[发明专利]通过反向脂肪酸氧化的官能化羧酸和醇

说明书

在先相关申请

本申请要求2011年9月7日提交的美国序列号61/531/911的优先权。本发明仅针对美国目的要求2011年2月7日提交的61/440,192的优先权，其通过引用整体并入。

联邦资助研究声明

本发明是在由国家科学基金颁发的CBET-1134541和CBET-1134541以及CBET-1067565拨款下借助政府资助进行的。政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及可以制备各种化学品用于工业用途的工程微生物。特别地，反向驱动脂肪酸氧化途径，将脂肪酸转化成原料和具有较少碳的专用化学品。

发明背景

我们已经表明β-氧化循环的工程化逆转可用于产生具有不同长度和官能度的侧链的直链脂族羧酸和正醇(61/440,192和PCT/US12/24051，2012年2月7日提交并且两者均通过引用整体并入本文)。在所有情况下，合成的分子为在ω末端处具有甲基的伯正醇或羧酸。本发明继续在反向β-氧化应用中进行研究并允许产物的进一步多样化。

为了概述在先基础的突破工作，用于驱动反向β-氧化循环的方法涉及以下三步：1)在不存在其天然诱导底物(即不存在脂肪酸)和存在非-脂肪酸碳源(如存在葡萄糖)的情况下功能性表达β氧化循环酶；2)在反向/生物合成方向中驱动β氧化循环(与其天然分解代谢/降解方向相反)；和3)表达作用于β氧化循环的合适的中间体的终止酶以制备所需产物。

更详细地，重组工程为：

1)在不存在其天然诱导底物(即不存在脂肪酸)和存在非-脂肪酸碳源(如存在葡萄糖)的情况下表达β-氧化循环:为了表达β-氧化循环，首先i)突变fadR和atoC(c)使得在不存在脂肪酸的情况下表达编码β氧化酶的基因；ii)arcA敲除(ΔarcA)使得在厌氧/微需氧的条件下编码β氧化循环酶/蛋白的基因能够表达(在燃料和化学品的生产中使用微需氧/厌氧条件但是导致β氧化基因被ArcA抑制)；和iii)用cAMP非依赖性突变体(crp*)替换天然的环状AMP受体蛋白(crp)使得在存在分解代谢产物抑制性碳源诸如葡萄糖(葡萄糖为在发酵过程中最广泛使用的碳源且抑制β氧化基因)的情况下表达编码β氧化循环酶/蛋白的基因。

2)以反向/生物合成方向驱动β氧化循环(与其天然分解代谢/降解方向相反)。除了功能性表达β-氧化循环，本途径的反向运行通过驱动朝向β氧化循环的乙酰-CoA及其前体并防止别处A-coA使用来驱动。具体地说，iv)使用微需氧/厌氧条件使通过TCA循环进行的乙酰-CoA的代谢最小化并制备可用来在反向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰-CoA；v)pta(或ackA或两者)、poxB、adhE、yqhD和eutE敲除减少由乙酰-CoA合成乙酸盐(Δpta或ΔackA和poxB)和乙醇(ΔadhE、ΔyqhD和ΔeutE)并因此制备可用来在反向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰-CoA；vi)硫解酶的过度表达，在β氧化循环的逆转中的第一步，使得乙酰-CoA引导至本途径并因此以相反方向运行；vii)ldhA、mgsA和frdA敲除分别减少由丙酮酸盐和磷酸烯醇丙酮酸盐合成乳酸盐(ΔldhA和ΔmgsA)和琥珀酸盐(ΔfrdA)，从而制备用于合成乙酰-CoA的更多的磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸盐且因此制备可用来在反向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰-CoA；viii)丙酮酸盐的过度表达：黄素氧还蛋白氧化还原酶(ydbK)和酰基-CoA脱氢酶(ydiO和ydiQRST)使得丙酮酸盐氧化(丙酮酸盐→乙酰-CoA+CO₂+Fd_red)和反式-Δ²-烯酰-CoA还原(反式-Δ²-烯酰-CoA+Fd_red→酰基-CoA)偶联并因此以相反方向驱动β氧化。

3)CoA硫酯中间体至所需终产物的转化。描述将反应中间体从反向β-氧化循环抽出并产生所需终产物的若干终止酶：

i)针对羧酸(即短的、中等和长链单羧酸，β-酮酸，β-羟基酸，反式-Δ2-脂肪酸)的CoA硫酯水解酶/硫酯酶或酰基-CoA：乙酰-CoA转移酶或磷酸转酰基酶和羧酸激酶，