[发明专利]硫酸化糖胺聚糖用于改善因子VIII的生物利用度的用途

说明书

本发明涉及包含至少一种因子VIII和硫酸化糖胺聚糖、用于在非静脉内施用后增加因子VIII的生物利用度的药物制剂。本发明还涉及因子VIII和硫酸化糖胺聚糖组合用于治疗和预防出血障碍的用途，其中因子VIII的生物利用度得到增加，以及涉及通过共施用硫酸化糖胺聚糖化增加因子VIII的非静脉内施用后生物利用度的方法。

发明背景

因子VIII(FVIII)

FVIII是哺乳动物肝脏中产生的分子量约280kDa的血浆糖蛋白。其为导致血液凝固的凝血反应级联的至关重要的组分。该级联中有一个其中因子IXa(FIXa)与活化的因子VIII(FVIIIa)一起将因子X(FX)转化成活化形式FXa的步骤。FVIIIa在该步骤中充当辅因子，其与钙离子和磷脂一起是使FIXa的活性最大化所需要的。最常见的血友病障碍是由被称为血友病A的功能性FVIII缺乏而引起的。

血友病A的治疗中的一项重要进展是分离到编码人FVIII的完整2,351个氨基酸的序列的cDNA克隆(美国专利No.4,757,006)以及提供了人FVIII基因DNA序列和其重组生产方法。

从克隆的cDNA确定的人FVIII的推导一级氨基酸序列的分析表明，其为从更大的前体多肽加工而成的异二聚体。该异二聚体由约80kDa的C末端轻链与以金属离子依赖性方式相缔合的约200kDa N末端重链组成。(参见Kaufman,Transfusion Med.Revs.6:235(1992)的综述)。该异二聚体的生理活化通过凝血酶对其蛋白质链的蛋白水解切割发生。凝血酶将重链切割成90kDa的蛋白质，随后将其切割成54kDa和44kDa的片段。凝血酶还将80kDa的轻链切割成72kDa的蛋白质。正是后一种蛋白质和通过钙离子保持在一起的两个重链片段(上述54kDa和44kDa)构成了活性FVIII。当44kDa A2重链片段从该分子上解离下来时或当72kDa和54kDa结构域被凝血酶、活化的蛋白C或FXa进一步切割时，发生失活。在血浆中，FVIII通过与50倍摩尔浓度过量的Von Willebrand因子蛋白(VWF)缔合而得以稳定，所述因子蛋白似乎抑制上述FVIII的蛋白水解破坏。

FVIII的氨基酸序列被组织成3个结构性结构域：三重330个氨基酸的A结构域、单个980个氨基酸的B结构域和二重150个氨基酸的C结构域。B结构域与其它蛋白质不具有同源性，并且提供该蛋白质的25个潜在天冬酰胺(N)-连接糖基化位点中的18个。B结构域似乎在凝血中不具有功能，并且可被缺失，该B结构域被缺失的FVIII分子仍然具有促凝血活性。

Von Willebrand因子(VWF)

VWF是存在于哺乳动物血浆中的多聚粘着糖蛋白，其具有多个生理功能。在主要的止血过程中，VWF充当血小板表面上的特异性受体与细胞外基质的组分例如胶原之间的介质。此外，VWF还充当促凝血因子FVIII的载体和稳定化蛋白。VWF在内皮细胞和巨核细胞中被合成为2813个氨基酸的前体分子。前体多肽（前VWF原）由22个残基的信号肽、741个残基的前肽和在成熟血浆VWF中发现的2050个残基的多肽组成(Fischer等人,FEBS Lett.351:345-348,1994)。在分泌进入血浆后，VWF以具有不同分子大小的不同种类的形式循环。这些VWF分子由具有2050个氨基酸残基的成熟亚基的寡聚体和多聚体组成。VWF通常可作为一个二聚体至由50–100个二聚体组成的多聚体形式发现于血浆中(Ruggeri等人，Thromb.Haemost.82:576-584,1999)。在人循环中人VWF的体内半衰期约为12小时。

人中最常见的遗传性出血障碍是维勒布兰德病(VWD)。取决于出血症状的严重度，VWD可通过利用含VWF（通常地来源于人血浆，但重组VWF也在开发中）的浓缩物的替代疗法来治疗。可从人血浆制备VWF，如例如EP0503991中描述的。在专利EP0784632中描述了分离重组VWF的方法。

已知VWF体内稳定FVIII，从而起着调节FVIII的血浆水平的关键作用，因此是控制原发性和继发性止血的中心因子。还已知在于VWD患者中静脉内施用含VWF的药物制剂后，可观察到在24小时内内源性FVIII:C达到1至3个单位/ml的增加，这表明VWF对FVIII的体内稳定作用。