[发明专利]修饰植物基因组的方法和手段

权利要求书

1.用于在预定位点修饰植物细胞的基因组的方法，其包括以下步骤：

a.在所述预定位点附近或在所述预定位点上诱导双链DNA断裂，所述双链断裂由向所述细胞中引入识别所述预定位点附近或所述预定位点上的识别序列的双链DNA断裂诱导(DSBI)酶来诱导；

b.选择植物细胞，其中已经修复了所述双链DNA断裂，导致基因组中在所述预选位点处的修饰，其中所述修饰选自

i.至少一个核苷酸的替换；

ii.至少一个核苷酸的缺失；

iii.至少一个核苷酸的插入；或

iv.i.–iii.的任一组合；

其特征在于所述预定位点紧靠现有的原种事件。

2.权利要求1的方法，其中所述事件是GHB119。

3.权利要求1或2的方法，其中所述识别序列包含在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中。

4.权利要求1-3任何一项的方法，其中所述识别序列包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

5.用于在预定位点修饰植物细胞的基因组的方法，其包括以下步骤：

a.在所述预定位点附近或在所述预定位点上诱导双链DNA断裂，所述双链断裂由向所述细胞中引入识别所述预定位点附近或所述预定位点上的识别序列的双链DNA断裂诱导(DSBI)酶来诱导；

b.选择植物细胞，其中已经修复了所述双链DNA断裂，导致基因组中在所述预选位点处的修饰，其中所述修饰选自

i.至少一个核苷酸的替换；

ii.至少一个核苷酸的缺失；

iii.至少一个核苷酸的插入；或

iv.i.–iii.的任一组合；

其特征在于所述识别位点包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的核苷酸序列。

6.权利要求1-5任何一项的方法，其中通过向所述细胞中递送包含编码所述内切核酸酶的一个或多个嵌合基因的核酸分子向所述细胞中引入所述DSBI酶。

7.权利要求1-6任何一项的方法，其中所述DSBI酶是单链大范围核酸酶或一对大范围核酸酶，其识别或一致识别所述预定位点并诱导所述双链断裂。

8.权利要求7的方法，其中所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对来自I-CreI，并且其中以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元1中：

a.   位置32处的S；

b.   位置33处的Y；

c.   位置38处的Q；

d.   位置80处的Q；

e.   位置40处的S；

f.   位置42处的T；

g.   位置77处的R；

h.   位置68处的Y；

i.   位置70处的Q；

j.   位置75处的H；

k.   位置44处的T；

l.   位置24处的I；

m.   位置26处的Q；

n.   位置28处的K；

o.   位置30处的N，

并且其中以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元2中：

p.   位置70处的S；

q.   位置44处的Q；

r.   位置24处的K；

s.   位置26处的A；

t.   位置28处的K；

u.   位置30处的N；

v.   位置32处的S；

w.   位置33处的Y；

x.   位置38处的Q；

y.   位置80处的Q；

z.   位置40处的S；

aa.  位置42处的T；

bb.  位置77处的Q；

cc.  位置68处的Y。

9.权利要求7或8的方法，其中所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对包含SEQ ID NO.6从氨基酸位置11-165和位置204-360的氨基酸序列。

10.权利要求7-9任一项的方法，其中所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对由包含或一起包含SEQ ID NO5从核苷酸位置3120-3584和位置3698-4169的核苷酸序列的一条或多条核苷酸序列编码。