[发明专利]用于STEC细菌的检测和鉴定的序列以及它们的使用

说明书

技术领域

本发明涉及基于核酸序列的存在检测和鉴定产志贺毒素大肠杆菌（Escherichia coli）的方法，优选基于PCR的检测方法，以及涉及寡核苷酸分子及用于其的试剂和试剂盒。

背景技术

大肠杆菌（E.coli）是革兰氏阴性、杆状细菌。虽然大多数大肠杆菌（E.coli）的菌株是良性的，并且被发现是人和其他动物的肠道正常菌群，但一些菌株是致病的并且能够导致疾病。不同的致病大肠杆菌（E.coli）菌株在流行病学，临床病程和导致疾病爆发的潜力方面是不同的。

产志贺毒素大肠杆菌（Escherichia coli）（STEC）是一种肠出血性大肠细菌，其可引起轻度至严重的肠道疾病，肾脏问题，甚至中枢神经系统效应。这些菌株的致病性是由于，在很大程度上，其产生的志贺样毒素Stx1和Stx2。另外，由eae基因编码的紧密黏附素粘附蛋白的生成已被证实与细菌的致病性有关，因为其具有某种表面抗原，包括O26、O111、O121、O45、O103、和O145抗原。

一种熟知的STEC细菌血清型是大肠杆菌（E.coli）血清型O157:H7，其已经与多起食物和水传播的爆发相关。美国农业部以零容忍标准控制这种细菌血清型作为碎牛肉中的掺杂物。由于其严格的监管，市场上存在众多针对大肠杆菌（E.coli）O157:H7的测试。然而，众多其他STEC细菌菌株也能致病，对其他STEC细菌血清型，或一般来讲STEC细菌的检测对于改善食品安全是很重要的。

因此，期望用于样品中STEC细菌的准确检测和鉴定的测试。

发明内容

本发明的一个方面是检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：

(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含适宜的引物对用于扩增eae基因、Stx1A基因和Stx2A基因中的一个或多个的至少一部分；

(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及

(c)检测步骤（b）的所述扩增。

在某些例子中，本发明涉及用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：

(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ ID NO:688（eae）的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5'末端和3'末端；其中所述第一引物包含SEQ ID NO:145或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；并且其中所述探针包含SEQ ID NO:160或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；

(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及

(c)检测步骤（b）的所述扩增。

在某些实施例中，所述第二引物包含核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO:191或其互补序列的至少15个连续的核苷酸。在另外的实施例中，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:146-159的序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:192-205的序列，并且所述探针包含选自SEQ ID NOs:161-175的序列。在附加的实施例中，所述探针的3'末端直接或间接连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在另外的实施例中，所述引物-探针复合物能被可检测地标记。在附加的实施例中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含SEQ ID NO:176的至少15个连续的核苷酸。在一些实施例中，所述样品包括食物样品或水样品。

在其他例子中，本发明涉及用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：

(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ ID NO:686（Stx1A）的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5'末端和3'末端；并且其中所述第一引物和探针选自：