[发明专利]用于检测核苷酸修饰的方法

权利要求书

1.一种在样品核苷酸序列中识别修饰的胞嘧啶残基的方法，包括；

(i)提供包括所述样品核苷酸序列的多核苷酸群体，

(ii)氧化或还原所述群体的第一部分，

(iii)用重亚硫酸盐处理氧化或还原的所述群体的第一部分和所述群体的第二部分，

(iv)在步骤ii)和iii)后，测序所述群体的所述第一和第二部分中的多核苷酸，以分别生成第一和第二核苷酸序列，以及；

(v)识别对应于所述样品核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述第一和第二核苷酸序列中的残基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第一和第二核苷酸序列中识别的残基表明在所述样品核苷酸序列中对应位置上的修饰的胞嘧啶。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述修饰的胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶（5mC）、5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）或5-甲酰基胞嘧啶（5fC）。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述群体的所述第一部分在步骤ii）中被氧化。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述氧化剂选择性地氧化5-羟甲基胞嘧啶残基。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中，步骤ii）包括氧化和纯化所述多核苷酸的第一部分的多个步骤。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中，所述第一部分使用化学氧化剂被氧化。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中，所述第一部分使用过钌酸盐氧化剂被氧化。

9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其中，所述第一部分使用KRuO₄被氧化。

10.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中，在所述第一核苷酸序列中的位置上识别对应于所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶残基的尿嘧啶和在所述第二核苷酸序列中相同位置上识别胞嘧啶，表明所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。

11.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中，在所述第一和第二核苷酸序列两者中的位置上识别对应于所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶残基的胞嘧啶，表明所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶（5mC）。

12.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中，在所述第一核苷酸序列中的位置上识别对应于所述所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶残基的胞嘧啶，表明所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶（5mC）。

13.根据权利要求4-12中任一项所述的方法，包括；

(vi)还原包括所述样品核苷酸序列的所述多核苷酸群体的第三部分，

(vii)用重亚硫酸盐处理所述群体的所述还原的第三部分，

(viii)在步骤vi)和vii)后，测序所述第三部分中的多核苷酸，以生成第三核苷酸序列，以及；

(ix)识别对应于所述样品核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述第三核苷酸序列中的残基。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，在所述第一、第二和第三核酸序列中识别的残基表明在所述样品核苷酸序列中对应位置上的修饰的胞嘧啶。

15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中，在所述第一和第二核苷酸序列中的位置上识别对应于所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶残基的尿嘧啶和在所述第三核苷酸序列中同一位置上识别胞嘧啶，表明所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-甲酰基胞嘧啶。

16.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述群体的所述第一部分在步骤ii）中被还原。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述群体的所述第一部分使用NaBH₄被还原。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中，在所述第一核苷酸序列中的位置上识别对应于所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶的胞嘧啶和在所述第二核苷酸序列中相同位置上识别尿嘧啶，表明所述样品核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-甲酰基胞嘧啶。