[发明专利]使用跨膜孔进行双链多核苷酸测序的发夹环方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的对双链靶多核苷酸进行测序的方法。靶多核苷酸的两条链通过桥连部分连接。多核苷酸结合蛋白分开所述靶多核苷酸的两条链。使用跨膜孔进行所述靶多核苷酸的测序。

背景技术

现在，在多种应用中需要快速且廉价的核酸（例如DNA或RNA）测序技术。现有的技术速度慢且价格昂贵，这主要是由于其倚赖于扩增技术来产生大量核酸并且需要大量专用的荧光化合物用于信号检测。

跨膜孔（纳米孔）具有巨大的潜力，作为用于聚合物和许多种小分子的直接的、电的生物传感器。具体而言，最近一直在关注作为潜在DNA测序技术的纳米孔。

当跨越纳米孔施加电势时，当分析物（例如核苷酸）短暂地在所述桶状体中存在一段时间时电流下降。所述核苷酸的纳米孔检测给出了具有已知特征和持续时间的电流阻断。然后可通过对单个孔的每单位时间阻断事件的数目来确定核苷酸的浓度（其中事件是分析物通过所述纳米孔的移位）。

在“链测序”方法中，使单个多核苷酸链通过所述孔，并直接鉴定所述核苷酸。链测序可包括使用核酸处理酶（例如Phi29DNA聚合酶）来控制多核苷酸移动通过所述孔。过去使用酶来控制dsDNA移位通过纳米孔的纳米孔测序的重点仅在于仅读取dsDNA构建体的一条链。当所述酶用作聚合酶时，待测序的部分是单链的。使所述单链部分穿入纳米孔，并在所述链顶部的引物/模板连接处加入dNTP而以受控方式牵拉所述单链部分通过纳米孔。大多数公布的文献使用该方法来控制链移动（Lieberman et al.(2010)"Processive Replication of Single DNAMolecules in a Nanopore Catalyzed by phi29DNA Polymerase"J.Am.Chem.Soc.132(50):17961-17972）。在聚合酶模式中，不能对互补链进行测序。当如所公开的（Lieberman et al.(2010)，上文）使用所述酶作为双链核酸外切酶时，互补链的解开伴随着该互补链的消化。因此不可能用该方法对互补链进行测序。因此不能通过纳米孔来捕获互补链并对其测序。因此，dsDNA中只有一半的DNA信息被测序。

更详细地，当聚合酶活性和核酸外切酶活性都被抑制（通过在没有三磷酸碱基但有过量EDTA的情况下运行）时，已经表明当被强的外加场牵拉通过纳米孔时，酶（例如Phi29DNA聚合酶）解开dsDNA（图1）（Lieberman et al.(2010)，上文）。这已经被称作解链模式。解链模式意味着在所述酶的上方或穿过所述酶的dsDNA解链，并且重要的是，破坏所述酶与两条链之间的相互作用和打开所述杂交的链之间的氢键的所需的必要力。过去认为第二互补链是有效的酶结合所必需的。此外，认为在所述酶的上方或所述酶中解开所述链所需的必要力是使DNA通过所述孔变慢的主要制动效应。在此我们描述了酶（例如Phi29DNA聚合酶）如何充当ssDNA的分子制动器，使得ssDNA能充分受控地穿过纳米孔，以围绕专门设计的dsDNA构建体的发夹转角进行测序，从而对dsDNA的正义链和反义链进行测序（图2）。过去解链模式主要使用模板进行，其中所述分析物的末端部分是平端的（图1）。偶尔使用小的发夹，但包括所述小的发夹只是为了简化DNA设计。先前的工作没有考虑过在长dsDNA上使用发夹，以提供读取两条链的能力。这是由于所述解链移动模式没有考虑过Phi29DNA聚合酶或相关酶在进入ssDNA区域时（即，当围绕发夹移动和沿着反义链移动时-图2）能够控制DNA的移动。

发明内容

本发明人已经出乎意料地证明，当双链靶多核苷酸的两条链通过桥连部分连接然后被分开时，纳米孔可对所述两条链进行测序。此外，本发明人还出乎意料地证明，酶，例如Phi29DNA聚合酶，能够分开通过桥连部分连接的双链多核苷酸（例如DNA）的两条链，并控制得到的单链多核苷酸移动穿过所述跨膜孔。

通过用桥连部分连接双链多核苷酸的两条链而对所述两条链进行测序的能力，具有许多优势，尤其是可对所述多核苷酸的正义链和反义链进行测序。这些优势在下文详细详述。

因此，本发明提供了一种对双链靶多核苷酸进行测序的方法，包括：

(a)提供包括所述靶多核苷酸的构建体，其中所述靶多核苷酸的两条链在所述靶多核苷酸的一个末端处或其附近通过桥连部分连接；

(b)分开所述靶多核苷酸的两条链以提供单链多核苷酸，所述单链多核苷酸包含通过所述桥连部分连接至所述靶多核苷酸另一条链的所述靶多核苷酸的一条链；