[发明专利]棒状细菌转化体和使用该转化体的缬氨酸的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及缬氨酸生产技术。更详细而言，涉及为了赋予缬氨酸生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体和使用该转化体的高效的缬氨酸的制造方法。

背景技术

在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。

作为必需氨基酸之一的缬氨酸，是作为医药、食品、化妆品的成分、家畜饲料添加物等有用的物质。以往，缬氨酸通过发酵法、蛋白质的水解来生产。

但是，对于利用以可再生资源为原料的发酵法的缬氨酸生产，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段数非常多，并且代谢酶受会到作为产物的缬氨酸的反馈抑制，由于上述等原因，生产率低已成为工业生产的课题。

作为利用基因重组菌的缬氨酸生产技术，可列举出专利文献1、2所述的技术。

专利文献1中公开了使用谷氨酸棒杆菌来制造缬氨酸的技术，所述谷氨酸棒杆菌中编码与L-异亮氨酸的生物合成有关的酶的基因、编码与L-亮氨酸的生物合成有关的酶的基因、和编码与D-泛酸的生物合成有关的酶的基因弱化或缺失，编码与L-缬氨酸的生物合成有关的酶的基因以使其表达增加的方式进行了突变。

另外，专利文献2中公开了利用使转氨酶C的活性增加后的棒杆菌属细菌来制造缬氨酸的技术。

但是，专利文献1、2的方法的缬氨酸的生产率在实用上还不充分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2009-521960

专利文献2：日本特表2008-514191

发明内容

发明所解决的课题

本发明的课题在于，提供能够以糖类为原料高效地制造缬氨酸的微生物、和使用该微生物以糖类为原料高效地制造缬氨酸的方法。

解决课题的手段

棒状细菌通过糖酵解将葡萄糖分解为丙酮酸。对于棒状细菌而言，进一步利用乙酰羟酸合成酶将丙酮酸代谢为2-乙酰乳酸，利用乙酰羟酸异构还原酶将2-乙酰乳酸代谢为2,3-二羟基异戊酸，利用二羟酸脱水酶将2,3-二羟基异戊酸代谢为2-酮异戊酸，利用转氨酶将2-酮异戊酸代谢为缬氨酸。

本发明人发现，在棒状细菌中导入由序列号37的碱基序列构成的乙酰羟酸合成酶基因、由序列号57的碱基序列构成的乙酰羟酸异构还原酶基因和由序列号40的碱基序列构成的亮氨酸脱氢酶基因中任意一种以上的基因后的转化体，以糖类为原料高效地生产缬氨酸。

由序列号37的碱基序列构成的DNA是谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因(ilvBN基因)的突变体，由序列号57的碱基序列构成的DNA是谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因(ilvC基因)的突变体。

另外，由序列号40的碱基序列构成的DNA是编码亮氨酸脱氢酶的DNA，在棒状细菌中可催化本来由转氨酶催化的由2-酮异戊酸向缬氨酸的转变。需要说明的是，转氨酶将氨基从其他氨基酸转移到2-酮异戊酸，与此相对，亮氨酸脱氢酶可以将氨基从无机NH₄⁺转移到2-酮异戊酸。

另外，本发明人发现，该转化体中存在于宿主棒状细菌的染色体上的乳酸脱氢酶基因破坏或缺失时，可以进一步高效地生产缬氨酸。

另外，本发明人发现，对于该转化体而言，使其在还原条件下的反应液中以实质上不增殖的状态反应的情况，与使其在好气性的反应液中边增殖边反应的情况相比，缬氨酸生产效率更高。

本发明基于上述见解而完成，提供以下的转化体和缬氨酸的制造方法。

第1项.一种转化体，其通过在宿主棒状细菌中导入下述(a)、(b)和(c)中任意一种以上的DNA而得到，

(a)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA；