[发明专利]芳族分子的重组生产系统

说明书

相关申请

本申请要求2011年6月23日提交的美国临时申请第61/500,518号和2012年1月5日提交的第61/583,325号的权益，该临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及在原核和真核宿主，如大肠杆菌(E.coli)、酵母、丝状真菌、藻类、微藻、其它植物细胞中生产芳族分子。

发明背景

目前存在从可再生资源中生产许多特种化学品和液体燃料的未实现的需要。尽管对地球的海洋和大气环境有很大的负面影响，大部分化学化合物和机动车燃料仍来源于化石燃料如原油、煤焦油、页岩油等。特别注意，简单酚类化合物如甲酚在过程中主要提取自煤焦油，该过程对环境有如此的负面影响以致专门生产甲酚的美国工厂近年来已关闭。然而，这不是全球性的方案，因为该问题可以简单地被转移到另一地理位置。合成生物学提供了制造某些特种化学品如这些的可能方案。

一般以类似于脂肪酸合成的方式通过缩合二碳单元来合成聚酮化合物。通常，合成包括启动单元和扩展单元；这些“二碳”单元来源于例如酰基硫酯，通常为乙酰基、丙酰基、丙二酰基或甲基丙二酰基辅酶-A硫酯。有四类聚酮化合物合酶(PKS)，其不同之处在于使用催化位点的“方式”(Watanabe and Ebizuka，2004)。I型模块化PKS是有多个“模块”的单个蛋白，其含有以线性“装配线”类型仅使用一次的催化位点。I型迭代PKS是具有重复使用以得到最终聚酮化合物产物的位点的单个蛋白。本发明可从每个类型中采用编码序列，但在优选实施方案中，采用的PKS将主要来源于例如芳族6-甲基水杨酸合酶，或苔色酸合酶，或这些酶的修饰形式的这类PKS。在异源微生物如酵母和大肠杆菌中，编码I型PKS多肽组分的基因已经被用于聚酮化合物的微生物生产。参见例如美国专利No.6,033,883、No.6,258,566和No.7,078,233。

II型PKS包含多个蛋白，其中每个蛋白具有单个单官能活性位点。活性位点可以只用一次或重复使用。最后，III型PKS是具有多个模块的单个蛋白，其中活性位点被重复使用。

PKS以与脂肪酸合酶(FAS)类似的方式工作。脂肪酸通常由疏水性组分组成，且可用作能源如在生物燃料中。许多真核生物使用共同的或相似的代谢途径合成脂肪酸。在种子中，储存作为甘油三酯一部分的脂肪酸作为能量来源用于进一步的发芽。FAS途径位于质体中。通过冷凝酶β-酮酰-ACP合酶(KAS)III形成乙酰-ACP(酰基载体蛋白)。延长乙酰-ACP至长链脂肪酸包括丙二酰-ACP的2-碳单元的循环缩合作用以形成更长的β-酮酰-ACP(β-酮酰-ACP合酶)、酮基官能团到醇的还原(β-酮酰-ACP还原酶)、形成烯酰-ACP的脱水(β-羟酰-ACP脱水酶)，以及最后还原烯酰-ACP以形成细长饱和的酰基-ACP(烯酰-ACP还原酶)。β-酮酰-ACP合酶I(KAS I)主要负责延伸至棕榈酰-ACP(C16:0)，而β-酮酰-ACP合酶II(KAS II)主要负责最终延伸至硬脂酰ACP(C18:0)。

类似地，通过示于图1和2的生物合成途径，迭代芳族PKS利用从丙二酰-ACP的2-碳单元的缩合以形成产物如6-甲基水杨酸(6-MSA)，也称为2-羟基-6-甲基苯甲酸(HMBA)和苔色酸(OSA)。通过简单地“敲除”酮还原酶(KR)结构域的催化活性可工程化细菌6-MSAS以合成OSA这一事实，这些途径的灵活性得以强调(Ding等，Chemistry&Biology17,495-503,2010)。

本发明提供在杀微生物、药物和可再生的液体燃料领域有多用途的分子和前体分子的生产系统。在一些实施方案中，添加用于酰基运载蛋白泛酸巯基乙胺基化(pantetheinylation)(即，用完整的ACP合酶，也称为PPT酶)的机器可在非必须天然生产此类分子的宽范围的宿主中生产所述分子。

由此从微生物宿主直接或间接获得的芳族分子，如甲酚、苔黑素、羟甲基苯甲酸及其同源的醚、酯和内酯，生成均相或非均相的化合物制剂，其或可进一步处理以生成适合用作杀微生物剂、药物、维生素、调味剂或可再生能源(如燃料、燃料添加剂例如含氧化合物、燃料辅助剂即高辛烷值汽油掺合剂等)的化合物。

附图简述

图1描述了6-MSA的生物合成途径(Beck等，Eur J Biochem192:487-498(1990))。