[发明专利]由蛋白G细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体组成的新型改性蛋白

说明书

【技术领域】

本发明涉及（包含）由抗体结合性蛋白蛋白G的细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体组成的新型改性蛋白质、编码该蛋白质的核酸、及利用了该蛋白质的抗体结合性的抗体、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的捕获剂、和填充了该捕获剂而得到的蛋白质分离纯化用层析用柱等。

【背景技术】

蛋白G是来源于链球菌的蛋白质，其是在链球菌（Streptococcus）属链球菌的细胞膜中存在的膜蛋白质，已知对免疫球蛋白G（抗体中的一种）的Fc区域具有特异性结合活性（非专利文献1、专利文献1）。蛋白G是由多个结构域组成的多结构域型膜蛋白质，显示有对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性（以下，称为“抗体结合活性”）的是其中的一部分的细胞膜外结构域（非专利文献2）。例如在图1中显示的来源于G148株的蛋白G的情况中，显示抗体结合活性的是B1、B2、B3这3个结构域（有文献也记做C1、C2、C3结构域）。另外，在GX7805株的蛋白G中存在3个抗体结合结构域，在GX7809的蛋白G中存在2个抗体结合结构域。已知这些均为将近60个氨基酸的小型蛋白质，在其氨基酸序列之间显示了高的相同性）。另外已知，切断蛋白G而将各结构域单独分开，仍保持抗体结合活性（非专利文献3）。

对于蛋白G的细胞膜外结构域而言，现在已上市，利用其选择性的抗体结合活性的多种含有蛋白G细胞膜外结构域的制品（例如，用于抗体纯化的亲和层析用载体（专利文献3、4）或用于检测抗体的检查试剂、研究试剂等）。已知蛋白G的细胞膜外结构域和抗体的结合力在中性～弱酸性区域高，在强酸性区域低（非专利文献4）。所以，当目的是抗体的分离、回收、纯化时，首先，使含血清等的抗体的样品溶液处于中性状态，使接触固定化蛋白G的细胞膜外结构域的珠等的水不溶性的固相支持体，选择性地吸附抗体。此后，用中性～弱酸溶液（pH5～8）清洗而除去抗体以外的成分。最后，通常加pH2.4～3.5的强酸性溶液而使抗体从固定化的蛋白G脱离，与强酸性溶液一同洗脱（专利文献3）。由此，可以高的纯度分离、回收、纯化抗体。

但是，抗体置于pH2.4～3.5的强酸性溶液的话会因变性凝集等而品质下降，根据抗体的种类的不同，有时还会丧失原本的功能（非专利文献4）。为了防止其发生，尝试在比pH2.4～3.5更高的pH的弱酸性区域处理，但由于蛋白G的细胞膜外结构域和抗体的结合力强，在弱酸性区域抗体不从蛋白G上洗脱下来，得不到足够的回收量。另一方面，已知蛋白G细胞膜外结构域还与Fab结合（非专利文献2）、一个抗体分子可在Fc区域和Fab区域这2个区域与蛋白G细胞膜外结构域结合。一旦变成这样的结合状态，则抗体和蛋白G的细胞膜外结构域不容易解离，难以回收抗体。

至今本发明人等也开发过由有热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对蛋白质分解酶的抗性等（有时将这些特性总称，简称为“蛋白质稳定性”）的蛋白G的细胞膜外结构域突变体组成的改性蛋白质（专利文献5及专利文献6）、还开发过在弱酸性区域的免疫球蛋白的Fc区域和的结合性和/或同Fab区域的结合性降低的改性蛋白质（专利文献7）。但是，这些改性蛋白质均仅含显示抗体结合活性的1个结构域。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1:特表平03-501801公报

专利文献2:专利第2764021号公报

专利文献3:特开平03-128400号公报

专利文献4:特开2003-088381号公报

专利文献5:特开2009-95322号公报

专利文献6:特开2009-118749号公报

专利文献7:特开2009-297018号公报

【非专利文献】

非专利文献1:Bjorck L，Kronvall G.（1984）Purification and some properties of streptococcal protein G，a novel IgG-binding reagent.J Immunol.133,969-974。

非专利文献2:Boyle M.D.P.，Ed.（1990）Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins.Academic Press，Inc.，San Diego，CA，USA。