[发明专利]改进的杆状病毒表达系统

说明书

本发明涉及优化的杆状病毒构建物，其可用于生产病毒（样）粒子或病毒载体，特别是用于基因治疗的病毒载体。

背景技术

杆状病毒表达载体系统（BEV）被用于在昆虫细胞中生产高水平的重组蛋白。它一般是基于杆状病毒多角体蛋白基因（polh）的缺失，所述基因被待表达的基因替换，所述待表达的基因在polh启动子的控制下。将细菌复制原点、抗生素抗性基因和受体Tn7重组位点整合到杆状病毒基因组中（即杆粒）极大地改进了这种系统，使其能够快得多地产生重组病毒（Luckow等，1993）。大多数可商购的杆状病毒载体缺少polh基因并除此之外具有完整的基因组，但是Oxford Expressionb Technologies公司以商品名flashBACGOLD发售几丁质酶基因和组织蛋白酶基因阴性的杆状病毒载体。因此，预期这种表达系统可以进行改进。已显示，从AcMNPV基因组缺失几丁质酶基因和组织蛋白酶基因对细胞内和分泌的重组蛋白的稳定性具有积极的影响（Kaba等，2004）。还已显示，几丁质酶、组织蛋白酶、p26、p10和p74缺陷的BEV允许生产与使用非缺失病毒获得的重组蛋白相比更高水平的重组蛋白（Hitchman等，2009）。然而，在这后一项研究中获得的表达数据仅涉及单一重组蛋白。为了生产复杂的结构例如病毒载体和病毒样粒子，必需生产一种或多种蛋白，并且在病毒载体的情况下，还必需生产病毒基因组。根据Hitchman等的结果，没有证据表明当几丁质酶基因、组织蛋白酶基因、p26基因、p10基因和p74基因缺失时，可以在蛋白质质量方面改善这样的复杂结构的生产。

本研究的目的是提供用于生产病毒载体和/或病毒样粒子的优化的杆状病毒表达系统。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种重组杆状病毒基因组，其包含p26和p74杆状病毒基因的ORF，同时杆状病毒的组织蛋白酶基因、几丁质酶基因和p10基因被破坏。在一种优选实施方式中，p10基因被破坏而没有缺失p10启动子。在另一种实施方式中，重组杆状病毒基因组包含一个或多个异源目的序列。

本发明的另一方面涉及一种重组杆状病毒基因组，其中杆状病毒的组织蛋白酶基因、几丁质酶基因、p26基因、p74基因和p10基因被破坏，并且其中所述重组杆状病毒基因组包含编码病毒载体或病毒样粒子的一部分的异源序列。

在另一方面，本发明提供了一种重组杆状病毒，其包含如上所述的重组杆状病毒基因组。

在另一方面，本发明提供了一种用于生产重组杆状病毒的方法，所述方法包括将含有本发明的重组杆状病毒基因组的原核细胞在允许生产杆状病毒的条件下进行培养。

在另一方面，提供了包含本发明的重组杆状病毒基因组的宿主细胞。

另一方面提供了一种用于生产重组蛋白或核酸（例如RNA或DNA分子或重组基因组，所述重组基因组是例如RNA或DNA基因组）的方法，所述方法包括将带有一种或数种本发明的重组杆状病毒的宿主细胞进行培养的步骤，其中异源目的序列编码重组蛋白或核酸。

在另一方面，本发明提供了一种用于生产病毒载体或病毒样粒子的方法，所述方法包括将带有一种或数种重组杆状病毒的宿主细胞进行培养的步骤，每种所述重组杆状病毒包含带有可用于生产所述病毒载体或病毒样粒子的异源目的序列的重组杆状病毒基因组，其中所有重组杆状病毒包含具有完整的p26和p74杆状病毒基因的ORF的重组杆状病毒基因组，其中杆状病毒的组织蛋白酶基因、几丁质酶基因和p10基因的ORF被破坏，并且其中p10基因的启动子未被破坏。

在另一方面，本发明提供了一种用于生产病毒载体或病毒样粒子的方法，所述方法包括将带有一种或数种重组杆状病毒的宿主细胞进行培养的步骤，每种所述重组杆状病毒包含带有可用于生产所述病毒载体或病毒样粒子的异源目的序列的重组杆状病毒基因组，

其中所有重组杆状病毒包含其中杆状病毒的组织蛋白酶基因、几丁质酶基因、p26基因、p74基因和p10基因被破坏的重组杆状病毒基因组。

在一种实施方式中，执行上述方法来生产重组AAV载体。