[发明专利]定量核酸酶保护测定（QNPA）和测序（QNPS）的改进

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年5月4日提交的美国临时申请No.61/482,486、2011年9月21日提交的美国临时申请No.61/537,492和2011年12月15日提交的美国临时申请No.61/576,143的优先权，所述临时申请全部以引用的方式纳入本文。

技术领域

本公开内容提供了改进的定量核酸酶保护测定（qNPA）和定量核酸酶保护测序（qNPS）方法。所述方法可用于核酸靶的鉴定、检测和/或测序。

背景技术

虽然已知检测和测序核酸分子的方法，但是仍然需要可允许同时分析多个样品或多个序列的方法。多路复用（multiplexing）核酸分子检测或测序反应的方法还没有达到最需要的性能或简单水平。

发明内容

本发明提供了可极大地改进现有的定量核酸酶保护测定（qNPA）和定量核酸酶保护测序（qNPS）方法并且代表对当前的核酸检测和测序方法的改进的方法。这些方法可用于核酸分子靶的鉴定、检测和/或测序。所述方法利用包括一个或多个侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）。所述NPPF包括与靶核酸分子的全部或一部分互补的序列，因而允许所述靶核酸分子和所述NPPF之间的特异性结合或杂交。例如，NPPF中与靶核酸分子中一个区域互补的区域以高特异性与所述靶核酸分子中的该区域结合或杂交（在一些实例中还可与双功能接头的一个区域结合）。NPPF还包括在所述NPPF的5′末端和/或3′末端的一个或多个侧翼序列。因此，所述一个或多个侧翼序列位于与靶核酸分子互补的序列的5′、3′或同时5′和3′。如果所述NPPF在5′末端和3′末端都包括侧翼序列，那么在一些实例中每个NPPF的序列均是不同的并且是不互补的。所述侧翼序列包括具有未在所述样品中的核酸分子中发现的序列（例如至少12个核苷酸的序列）的若干个连续的核苷酸，并且提供通用的杂交和/或扩增序列。这种通用的杂交和/或扩增序列，当其具有与扩增引物的至少一部分互补的序列时，可允许进行多路复用，因为相同的扩增引物可用于扩增特异性针对不同靶核酸分子的NPPF。其还为所有NPPF提供了通用杂交序列，所述通用杂交序列可用于将可检测标记添加到NPPF上或者用于捕获并浓缩NPPF。例如，如果相同的侧翼序列存在于特异性针对不同靶核酸分子的NPPF上，那么相同的引物可用于扩增任何具有相同侧翼序列的NPPF，即便所述NPPF靶向不同的核酸分子。例如，所述侧翼序列可用于捕获NPPF，例如捕获到表面上。所述侧翼序列可以含有可变的序列，例如特异性针对每种具体NPPF的序列，并且所述序列可被用于将所述NPPF捕获到表面或用于其他目的，例如鉴定所述NPPF。因此，在一些实例中，所述公开的方法可用于使用多种NPPF检测样品中若干种不同的靶核酸分子或对其测序，其中每种NPPF特异性结合至一种特定的靶核酸分子。在一个实例中，所述公开的方法被用于同时检测或测序多个样品中的至少一种靶核酸分子。

本公开内容提供了用于检测或确定样品中至少一种靶核酸分子的序列的方法。所述方法可以包括使所述样品（例如已经被加热以使样品中的核酸分子变性的样品）与至少一种NPPF在足以使得所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触。所述NPPF分子包括与所述靶核酸分子的全部或一部分互补的序列。这使得所述NPPF与所述靶核酸分子之间特异性结合或杂交。所述方法还包括使所述样品与一种或多种具有与侧翼序列的全部或一部分互补的序列的核酸分子（本文中这种分子被称为CFS）在足以使得所述侧翼序列与所述CFS特异性结合或杂交的条件下接触。多于一个的CFS可用于与整个侧翼序列杂交（例如，多个单独的CFS可与单个侧翼序列杂交，使得整个侧翼序列被覆盖）。这导致产生了已经结合（杂交）至所述靶核酸分子以及所述一个或多个CFS的NPPF分子，从而产生双链分子，所述双链分子可以包括至少四个连续的寡核苷酸序列，并且所有碱基都与互补的碱基杂交。

在使得所述靶核酸分子和所述一个或多个CFS结合至所述NPPF后，所述方法还可包括使所述样品与特异性针对单链（ss）核酸分子（或核酸分子的单链区域）的核酸酶在足以除去未与互补碱基杂交的核酸碱基的条件下接触。因此例如，未结合靶核酸分子或CFS的NPPF、以及未结合的靶核酸分子、样品中其他单链核酸分子和未结合的CFS会被降解。这产生了经消化的样品，其包括以与一个或多个CFS和靶核酸分子的双链加合物的形式存在的完整NPPF。在一些实例中，所述方法还包括提高所述样品中的pH和/或加热样品，想解离或除去结合至所述NPPF的靶核酸分子和CFS。