[发明专利]由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法。

背景技术

治疗用抗体由于其疗效高和副作用风险小而取得了巨大成功，但因其制造成本高而引起的高药价则成为课题。该抗体的疗效局限于白血病或自身免疫疾病等较窄的疾病范围，在药物的组织转移性受到限制的固体癌症等中不太有效，这也成为课题。

自从1988年可以在大肠杆菌内制备抗体片段(非专利文献1～3)以来，组织转移性高、低分子化的修饰抗体(抗体片段)的开发持续进行。为了获得更高的抗癌效果，有多种使抗体片段与抗癌药、毒素、放射性同位素或前体药物活化酶等融合而得到的抗体融合蛋白也被提案。

但是，当天然抗体所具有的二价结合性是发挥其与靶抗原的高亲和性和优异的体内动力学的基础时，人工制作的一价抗体融合蛋白与靶抗原的结合性不及天然抗体的结合性。

因此，最近将低分子化修饰抗体或抗体融合蛋白形成多价的试验逐渐盛行(非专利文献4)。如果能够使用微生物廉价地生产抗体这样的多价分子，那么当然可以满足高功能和低药价这两个方面。

如双抗体、三链抗体或模仿免疫球蛋白M的抗体那样，已知利用抗体结构自身的缔合性来制备多价分子的方法。作为其他方法，还有通过使缔合性蛋白与抗体的片段结构融合而得到多价分子的方法。其例子有：经由与单链抗体可变区(scFv)结合的亮氨酸拉链结构等进行二聚化的方法(非专利文献5)或经由来自人p53的四聚体化α螺旋结构的方法(非专利文献6)、利用来自微生物的链霉亲和素的四聚体化的方法等。特别是，关于使链霉亲和素融合的方法，已经通过链霉亲和素的结构修饰实现了高功能化(提高稳定性和溶解性、降低免疫原性等)(非专利文献7)。融合了链霉亲和素的蛋白可以经由以高亲和性与链霉亲和素结合的生物素分子实现药物预靶向作用，因此是最受期待的多价融合蛋白之一(非专利文献7)。

其中，问题在于：使用大肠杆菌等微生物生产多价融合蛋白时，往往会在微生物的菌体内形成不溶性蛋白。在微生物的菌体内不溶性的蛋白丧失了活性或稳定性，所以为了将该蛋白作为药品等来使用，必需重新进行用于重建活性结构的重折叠操作。

Schultz等人通过想办法研究与链霉亲和素结合的scFv内的肽接头或H链与L链的配置顺序，报道了在大肠杆菌的菌体内以可溶性且活性型的方式生产的例子(非专利文献8)。但是，可知若将链霉亲和素改变成修饰型，则其在大肠杆菌的菌体内不溶(非专利文献9)。因此，在链霉亲和素融合蛋白的实用化上，认为必需进行重折叠操作。

由于这样的情况，Choe等人研究了修饰型链霉亲和素融合蛋白的重折叠例子(非专利文献10)，但目标物的回收率远远低于1%，在实用化上还存在很多课题。

本发明人之前提出了使由于不溶化或丧失了高级结构而失去了活性或稳定性的蛋白(改性蛋白)恢复天然状态的高级结构的方法(重折叠方法)(专利文献1)。根据该方法，使用1～3%的预定的酰基谷氨酸表面活性剂水溶液在pH6.5～9.0下增溶已改性沉淀的蛋白，之后，使用精氨酸缓冲液将该增溶后的溶液的表面活性剂浓度降低至0.02～0.5%，从而可以有效地重建蛋白结构。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2009/136568号；

非专利文献

非专利文献1：Science, 240, 1038-1041 (1988)；

非专利文献2：Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)；

非专利文献3：Science, 242, 423-426 (1988)；

非专利文献4：Nature Reviews Immunology, 10 345-352 (2010)；

非专利文献5：Biochemisry (Mosc), 31, 1579-1584 (1992)；

非专利文献6：Journal of Immunogy, 157, 2989-2997 (1996)；

非专利文献7：Journal of Controlled Release 65, 203-220 (2000)；

非专利文献8：Cancer Research, 60, 6663-6669 (2000)；