[发明专利]安全测序系统

说明书

存在于小部分DNA模板中的突变的识别对生物学研究的几个领域的发展是至关重要的。虽然大量平行测序仪器基本上非常适合该任务，但是这样的仪器中的差错率通常太高以至于不允许稀有变体的确信识别。我们这里描述了用于该目的的可大大增加大量平行测序仪器灵敏度的方法。该方法——称作“安全测序系统”——的一个实例包括（i）给每个模板分子分配独特识别符（UID）；（ii）扩增每个独特标记的模板分子以产生UID‑家族；和（iii）扩增产物的丰余测序。如果它们的≥95%含有相同的突变，那么具有相同UID的PCR片段是真正的突变体（“超突变体”）。我们显示用于测定聚合酶保真度的该方法的实用性、体外合成的寡核苷酸的准确度、和正常细胞的核和线粒体基因组中的突变流行。

本发明利用国立卫生研究院的资助CA62924、CA43460和CA57345而作出。本发明的某些权利在资助条款下由美国政府保留。

发明的技术领域

本发明涉及核酸测序领域。特别地，涉及分析和验证低频率事件的产物的操作和分析步骤。

发明背景

基因突变分别成为生存和死亡——进化和疾病自始至终的许多方面的基础。相应地，它们的测量对几个研究领域是关键的。Luria和Delbrück的经典的波动分析是对生物学过程洞察的原型实例，该生物学过程可通过计数仔细控制的实验中突变的数目而简单地获得(1)。计数人类中不存在于它们的父母中的新形成的突变已相似地导致对我们的物种可进化的速度的新洞察(2、3)。相似地，计数肿瘤中遗传或后生变化可告知癌症生物学的基本问题(4)。在处理患有病毒疾病如AIDS和肝炎的患者中，由于它们可引起的抗药性，突变位于目前的问题的核心(5、6)。这样的突变的检测，特别地在它们变得在人口中占优势之前的阶段，对优化治疗将可能是必不可少的。器官移植患者的血中供体DNA的检测是移植物排斥的重要指示器，并且母亲血浆中胎儿DNA的检测可用于非创伤方式的产前诊断(7、8)。在均由体细胞突变驱动的肿瘤病中，稀有突变体检测的应用是各种各样；当在血浆中评价时，它们可用于辅助识别在手术边缘或在淋巴结中残余的疾病，以继续治疗过程，和当在粪便、唾液、血浆和其它体液中评价时，也许识别患有早期的手术可医治的疾病的患者(9-11)。

这些实例强调了对于基础和临床研究识别稀有突变的重要性。相应地，在几年里人们已想出了评价它们的创新的方法。第一方法包括基于原养型、对病毒感染或药物的抵抗或生物化学测定的生物学测定(1、12-18)。分子克隆和测序为该领域提供新的尺度，因为它允许识别突变类型而不仅仅是它的存在(19-24)。这些较新的方法中效力最大的一些基于数字PCR，其中个体分子被逐一评价(25)。数字PCR在概念上与细菌、细胞或病毒的个体克隆的分析相同，但是用限定的、无生命的试剂完全在体外进行。数字PCR的几个实现已被描述，包括多孔板中、群落(polonies)中、微流体装置中和油包水乳状液中排列的分子的分析(25-30)。在这些技术中的每个中，突变体模板通过它们结合到对潜在的突变体碱基特异的寡核苷酸而被识别。

大量平行测序代表特别地有效力的形式的数字PCR，因为许许多多模板分子可被逐一分析。它较常规的数字PCR方法具有优势，因为多个碱基可以以自动化方式被连续地和容易地询问。然而，由于与测序过程相关的高差错率，大量平行测序不能通常用于检测稀有变体。例如，通常使用的Illumina测序仪器，该差错率从～1％(31、32)至～0.05％(33、34)变化，取决于因素如阅读长度(35)、改进的碱基召唤算法(base calling algorithms)的使用(36-38)和检测的变体的类型(39)。这些错误中的一些可能由模板制备期间、文库制备所需的预扩增步骤期间和仪器自身上进一步固相扩增期间引入的突变而产生。其它错误是由于测序期间碱基错误掺入和碱基召唤错误。碱基召唤的改进可提高可靠性(例如，(36-39))，但是基于仪器的误差仍然是限制性的，特别地在临床样品中，其中突变流行率可以是0.01％或更少(11)。在下面描述的工作中，我们显示模板如何可被制备和从它们中获得的测序数据如何可被更可靠地解释，以便相对稀有的突变可以用商业上可用的仪器识别。

在本领域中存在对提高研究、临床、法医和系谱目的的序列测定的灵敏度和准确性的持续需求。