[发明专利]发酵方法

说明书

背景

本发明涉及用于产生重组蛋白的方法，具体是包括培养表达重组蛋白的宿主细胞和使宿主细胞成熟的步骤的用于产生重组蛋白的方法。本发明还提供了通过本发明的方法可获得的重组蛋白，和包括所述重组蛋白的免疫原性组合物或疫苗。

某些毒素的表达已知是有挑战性的，例如白喉毒素。DT可以通过纯化来自白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的培养物的毒素，随后通过化学解毒产生，或者可以通过纯化毒素的重组或遗传解毒的类似物制成(例如CRM197，或US4,709,107、US5.846.711、US5,601,827和US5,917,017中描述的其它突变体)。

由于低蛋白丰度，用于疫苗中的白喉毒素例如CRM197的大量的产生已被阻碍。此问题先前已通过在大肠杆菌中表达CRM197(Bishai 等 J. Bacteriol. 169:5140-5151)得以解决，Bishai 等描述了包含白喉毒素(包括tox信号序列)的重组融合蛋白的表达，这导致降解的蛋白的产生。

包含tox信号序列的白喉片段的克隆和这些序列在大肠杆菌中的表达涉及某些困难。表达的蛋白分泌到周质间隙并且此分泌伴随宿主细胞的活力降低(O’Keefe 等 Proc. Natl, Acad. Sci. 86:343-346)和重组蛋白的蛋白水解增加(Bishai等 J Bacteriol. 169:5140-5151)。由于这些原因，已经暗示去除tox信号序列使得表达不再是在周质，这可以增加白喉类毒素的表达(Bishai等)。

PCT/EP2010/065047 (WO 2011/042516)首次公开了成功的CRM197的周质表达。这增加了CRM197的产量，但是即使如此，仍然可以进行对提取方法的改善以增加产量。Rathore公开了渗透压程序的优化，用于在大肠杆菌中表达的蛋白产物的分离(Rathore 等Biotechnol.Prog. 2003, 19, 1541-1546)。Bochner等还公开了用于从宿主细胞回收周质蛋白的方法(US4680262)。

从而本发明提供了改善的用于产生重组多肽的方法，其包括使宿主细胞成熟的步骤，其中此步骤可以包括下列的任一或更多：

(1) 使宿主细胞接受pH休克；

(2) 孵育宿主细胞；或

(3) 冷冻宿主细胞。

此使宿主细胞成熟的步骤具有实质上增加蛋白提取效率的令人惊讶的结果。

简要概述

在第一实施方案，提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤：

a) 在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列。

a(i)) 诱导所述细菌类毒素的表达；

b) 使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括：

I) 使宿主细胞接受pH休克；

II) 无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或

III) 使宿主细胞接受低于-20℃的温度；和

c) 从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。

在第二实施方案，提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤：

a) 提供包括在周质中表达的细菌类毒素的革兰氏阴性宿主细胞；

b) 使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括：

I) 使宿主细胞接受pH休克；

II) 无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或

III) 使宿主细胞接受低于-20℃的温度；和

c) 从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。

在第三实施方案中，提供了通过本发明方法可获得或通过本发明方法获得的细菌类毒素。

在第四实施方案，提供包括本发明细菌类毒素和药学可接受赋形剂的免疫原性组合物。

在第五实施方案，提供包括本发明免疫原性组合物的疫苗。

在第六实施方案，提供本发明的免疫原性组合物或疫苗在用于疾病的预防或治疗的药物的制造中的用途。

在第七实施方案，提供了预防或治疗疾病的方法，包括向患者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。

附图简述