[发明专利]序列特异性工程改造的核糖核酸酶H和用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白序列偏好的方法无效
| 申请号： | 201280027647.2 | 申请日： | 2012-06-07 |
| 公开（公告）号： | CN103764820A | 公开（公告）日： | 2014-04-30 |
| 发明（设计）人： | J.M.布尼基;A.A.苏勒;K.J.斯科罗内克;M.诺沃特尼 | 申请（专利权）人： | 国际生物分子和细胞研究所 |
| 主分类号： | C12N9/22 | 分类号： | C12N9/22 |
| 代理公司： | 中国专利代理(香港)有限公司 72001 | 代理人： | 林毅斌;庞立志 |
| 地址： | 波兰*** | 国省代码： | 波兰;PL |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 序列 特异性 工程 改造 核糖 核酸酶 用于 确定 dna rna 杂交 结合 蛋白 偏好 方法 | ||
1. 一种核糖核酸酶，所述核糖核酸酶切割DNA-RNA杂交物中的RNA链，其中核糖核酸酶为包含核糖核酸酶HI (RNA酶HI)的催化结构域或其衍生物与锌指DNA-RNA杂交物结合结构域的融合蛋白，并且其中所述锌指结合结构域能够与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结合。
2. 权利要求1的核糖核酸酶，其中所述RNA酶HI的催化结构域的衍生物包含RNA酶HI杂交物结合结构域的缺失。
3. 权利要求1或2的核糖核酸酶，其中所述RNA酶HI的催化结构域优选来自耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)，优选包含由SEQ ID No:1所示rnhA基因的第175-588位核苷酸编码的多肽。
4. 权利要求3的核糖核酸酶，其中所述RNA酶HI的催化结构域在底物结合区包含一个氨基酸的至少一个取代，所述取代选自：K81A、K89E和K123A，以及优选包含全部取代K81A、K89E和K123A。
5. 权利要求1-4的核糖核酸酶，其中所述锌指结构域为锌指ZfQQR的衍生物，优选为由SEQ ID No.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸编码的多肽。
6. 权利要求1-5的核糖核酸酶，其中其包含如SEQ ID No.4所示的融合蛋白catAEA-ZfQQR。
7. 权利要求1-5的核糖核酸酶，其中其包含如SEQ ID No.6所示的融合蛋白GQ。
8. 权利要求1-5的核糖核酸酶，其中其包含如SEQ ID No.8所示的融合蛋白GGKKQ。
9. 一种组合物，所述组合物包含权利要求1-8的核糖核酸酶。
10. 权利要求1-8的核糖核酸酶或权利要求9的组合物在切割DNA-RNA杂交物的RNA链中的用途。
11. 权利要求10的用途，其中DNA-RNA杂交物中RNA链的切割位于远离锌指结合位点的2-16个核苷酸，优选5-7个核苷酸。
12. 一种获得工程改造的RNA酶HI变体的方法，所述变体切割DNA-RNA杂交物中的RNA链，所述方法包括以下步骤：
a)优选通过去除结合结构域和/或涉及底物结合的氨基酸的取代，获得不结合底物但保留催化活性的RNA酶HI催化结构域；
b)通过制备融合蛋白获得工程改造的RNA酶HI，所述融合蛋白包含在步骤a)中获得的RNA酶HI催化结构域与能够结合DNA-RNA杂交物中特异性序列的结合结构域，所述结合结构域优选锌指DNA-RNA杂交物结合结构域。
13. 权利要求12的方法，其中所述锌指结构域为锌指ZfQQR的衍生物，优选为由SEQ ID No.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸编码的多肽。
14. 权利要求12-13的方法，其中所述RNA酶HI的催化结构域优选来自耐盐芽孢杆菌，优选包含由SEQ ID No:1所示rnhA基因的第175-588位核苷酸编码的多肽。
15. 权利要求12-14的方法，其中所述RNA酶HI的催化结构域包含在底物结合区的改变，所述改变优选选自至少一个氨基酸残基的取代、缺失或插入。
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