[发明专利]用于生成致密TALE-核酸酶的方法及其用途

权利要求书

1.一种用于靶向和加工双链DNA的方法，其包括：

（a）在双链DNA的一条链中选择一条目的DNA靶标序列；

（b）提供包含以下的独特的致密TALEN单体：

（i）一个核心TALE支架，所述核心TALE支架包含对所述目的DNA靶标序列具有DNA结合特异性的重复可变二肽区（RVD）；

（ii）至少一个催化结构域，其中所述催化结构域当与来自（i）的所述核心TALE支架的C和/或N端融合时能够加工距所述目的DNA靶标序列几个碱基对远的DNA；

（iii）任选的一个肽接头，所述肽接头在需要时使来自（ii）的所述催化结构域与来自（i）的所述核心TALE支架融合；

其中所述致密TALEN单体装配成结合并加工所述双链DNA而不需要二聚化；

（c）使所述双链DNA与所述独特的单体相接触，使得所述双链在3’和/或5’方向上在距所述一条链靶标序列几个碱基对远处被加工。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化结构域对所述双链DNA具有切割活性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化结构域与所述核心TALE支架的C端结构域融合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化结构域与所述核心TALE支架的N端结构域融合。

5.根据权利要求1所述的方法，其中一个催化结构域与所述核心TALE支架的所述C端结构域融合并且另一个催化结构域与所述核心TALE支架的所述N端结构域融合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域选自表2所列的蛋白质或其功能突变体。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域是I-TevI（SEQ ID NO:20）或其功能突变体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中I-TevI（SEQ ID NO:20）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端结构域融合。

9.根据权利要求8所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:426至432的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。

10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域是ColE7（SEQ ID NO:11）或其功能突变体。

11.根据权利要求10所述的方法，其中ColE7（SEQ ID NO:11）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述C端部分融合。

12.根据权利要求10所述的方法，其中ColE7（SEQ ID NO:11）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端部分融合。

13.根据权利要求11所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:435至438的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。

14.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域是NucA（SEQ ID NO:26）或其功能突变体。

15.根据权利要求14所述的方法，其中NucA（SEQ ID NO:26）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述C端部分融合。

16.根据权利要求14所述的方法，其中NucA（SEQ ID NO:26）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端部分融合。

17.根据权利要求15所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:433至434的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。

18.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域是I-CreI（SEQ ID NO:1）或其功能突变体。

19.根据权利要求18所述的方法，其中I-CreI（SEQ ID NO:1）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述C端部分融合。