[发明专利]在袋中的微载体上培养细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及在袋中培养细胞，并且更特别地，涉及在微载体上对细胞进行灌注培养。本发明还涉及用于在微载体上对细胞进行灌注培养的袋。

背景技术

生物处理行业在传统上在制造过程中使用不锈钢系统和管道来进行发酵和细胞培养。这些装置设计成可经蒸汽灭菌和重复利用。但是清洗和灭菌是昂贵的劳动密集型工作。此外，对这些传统系统安装必需的管道和设施的成本常常是非常高的。此外，这些系统典型地设计成用于特定过程，而且无法针对新应用容易地重新配置。在过去的十年里，这些限制已经导致采用新方法，即使用塑料的一次性袋和管道来代替通常的不锈钢罐。

特别地，传统上由不锈钢制成的生物反应器已经在许多应用中被一次性袋所取代，摇动一次性袋，以提供必要的通气和细胞培养必要的混合。这些一次性袋典型地提供无菌性，并且消除昂贵且耗时的清洗和消毒步骤。袋设计成在运行期间保持无菌环境，从而最大程度地降低污染风险。

常用的袋为“枕头式”，主要是因为可通过将两张柔性塑料片材缝在一起以低成本制造这些袋。也已经描述了三维袋，其中，可使用另外的片材来建立壁结构。

成功的一次性生物反应器系统之一使用其上放有生物反应袋的摇动台。生物反应袋部分地装有液体营养介质和期望细胞。台摇动袋，从而对袋中的细胞提供持续的运动，而且还提供与扰动的空气-液体表面的高效气体交换。典型地，袋具有用于引入空气、二氧化碳、氮或氧的至少一个气体供应管，以及用以允许移除呼吸气体的至少一个排气管。可通过其它管添加营养物。

传统上，以批量模式进行细胞培养。在批量操作中，对生物反应器种少量细胞，并且细胞生长成较高的密度。细胞产生所关注的产物，并且在收集培养物时，最终由于缺乏营养物或有毒代谢物增多而死亡。此方法具有几个缺点，首先，大部分营养物在简单的生长细胞中被浪费，而且未直接用于制造产物；其次，产物的形成往往由于有毒的代谢副产物增多而被抑制；以及最后，关键营养物常常被损耗，从而导致最终细胞密度低，并且因此导致产量较低。

长久以来认可的是，灌注培养对于一些过程提供较好的经济性。在这个操作中，细胞保留在生物反应器中，而有毒的代谢副产物持续地被移除。持续地添加包含营养物的给料。这个操作能够实现高细胞密度，而且更重要的是，细胞可在数周至数月中保持处于高繁殖状态。这实现较高的产量，并且减小生物反应器所需的大小。它也是对于培养初生细胞或其它慢生长细胞来说有用的技术。灌注操作具有生长人类细胞和基因治疗应用所需的大量细胞的巨大潜力。

许多细胞类型在自由悬浮液中的生长情况不佳，而且在大规模培养中，它们通常生长在微载体上，即，对细胞提供生长表面的微粒上。

Vero和MDCK细胞广泛地用于产生病毒疫苗，诸如脊髓灰质炎、麻疹、流行性感冒、狂犬病或肠病毒。对于大规模培养，细胞系通常在微载体上生长，体积高达6000升。病毒产量常常与细胞浓度相互关联，并且因此方法努力在感染之前获得高细胞数。但是，细胞的营养物供应和代谢对可实现的病毒浓度有重要影响。已经观察到，由于所谓的“细胞密度效应”，使细胞浓度提高到某个水平之上不再能够改进病毒产量。怀疑这是因为在批量和批量给料条件下积聚的抑制剂的原因(Yuk等人的Cytotechnology(细胞技术学)51(3)，183-192，2006)。已经显示，与批量培养相比，在灌注系统中进行充足的营养物供应和移除细胞培养产生的废产物可使病毒产量提高五至七倍(Rourou等人的Vaccine(疫苗)25(19)，3879-3889，2007)。在微载体培养期间，无活性细胞可与微载体脱开，并且细胞碎片可由于物理消耗或细胞溶解而形成。移除碎片微粒和游离细胞两者是合乎需要的，因为它们可释放蛋白酶、细胞因子、DNA等，这对固定不动的细胞在培养中的生存能力有负面影响。另外，如果从生物反应器中移除微粒，而非使微粒在过程期间积聚，细胞保持物的工作寿命将得到改进。

可通过使用例如US 6544788或US 20110020922中描述的袋设计来在摇动袋中对自由悬浮液中的细胞进行灌注培养。这里，袋中的曲折小孔过滤器保留细胞，并且允许从培养中移除无微粒的液体。但是这些结构不适于在微载体上对细胞进行灌注培养，其中，除了液体，移除诸如细胞碎片和游离细胞的微粒是合乎需要的。因此，需要允许在具有微载体的袋进行灌注培养的新方法和结构。

发明内容

本发明的一方面是提供一种允许在微载体上对细胞进行高效的灌注培养的方法。用权利要求1中限定的方法来实现这一点。此方法的一个优点在于，它允许在培养期间高效地移除细胞碎片和游离细胞。