[发明专利]可溶性LR11的免疫学测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物来源试样中的可溶性LR11的免疫学测定方法。

背景技术

LDL receptor relative with11ligand-binding repeats（LR11）是LDL受体家族中具有特征性结构的分子量约250kD的LDL受体样蛋白质（专利文献1、非专利文献1），除了膜结合型以外，还存在通过蛋白酶切断的可溶性LR11（非专利文献4）。LR11在正常血管壁细胞中基本没有发现，但是，已有报道可在肥厚内膜的平滑肌细胞中特异性地发现（非专利文献2）。另外报告了伴随培养平滑肌细胞的增殖，LR11的表达量亢进，培养液中分泌有可溶性LR11；在肩袖障碍模型小鼠中，如果使LR11基因发育工程性功能缺失，则因平滑肌细胞的游走和增殖而引起的血管内膜的肥厚受到抑制（非专利文献3）。进一步地，本发明人等发现，动脉硬化性疾病患者血液中可溶性LR11的浓度与健康人相比出现显著的高值，可以将血液中存在的可溶性LR11作为新的动脉硬化性疾病的标记而进行利用（非专利文献5，专利文献2）。

作为可溶性LR11的测定方法，已知有利用使对LR11具有亲和性的分子伴侣RAP（receptor associated protein）结合而得的不溶性载体，从试样中分离可溶性LR11后，进行SDS-PAGE、免疫印迹（Western Blot），通过抗LR11抗体进行免疫染色的检测方法（非专利文献5、6），但是，以从试样中分离可溶性LR11的工序为代表，操作多而复杂，应用到临床检查等情况下，并非是实用的方法。

作为操作简便且实用性的可溶性LR11的测定方法，本发明人等尝试确立使用抗可溶性LR11抗体的免疫学的测定方法，但是在使用血清等生物来源试样作为试样时，可知由于上述试样中存在的不确定的测定干扰物质（以下，简单称为“干扰物质”）的影响，无法准确定量可溶性LR11。

因此，本发明人等对于避免干扰物质给免疫学测定方法带来的影响的方法，进行了广泛研究。结果发现，将血清等生物来源试样与N-酰基-N-甲基葡糖胺等特定的表面活性剂进行混合处理，应用该处理后的试样以免疫学测定方法进行测定，则能够避免干扰物质的影响，能够简单且准确地定量试样中的可溶性LR11，对此已经提出专利申请（专利文献3）。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平9-163988号公报

专利文献2：国际公开WO2008/155891号小册子

专利文献3：国际公开WO2009/116268号小册子

非专利文献

非专利文献1：J.Biol.Chem.1996;271,p24761-24768

非专利文献2：Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.1999;19,p2687-2695

非专利文献3：Circ.Res.2004;94;p752-758

非专利文献4：医学的进展,Vol.221,No.13,p1200-1203

非专利文献5：J Clin Invest.2008;118,p2733-2746

非专利文献6：第39届日本动脉硬化学会总会·学术集会大纲·抄录集，一般标题（海报）189，p264

发明内容

但是，专利文献3记载的现有方法（以下，简称为“现有方法”），例如，利用使用了2种抗可溶性LR11抗体的夹心ELISA测定经N-酰基-N-甲基葡糖胺处理的人血清试样的方法中，由于固相化的抗可溶性LR11抗体与可溶性LR11的反应（以下称为“一次反应”）在室温需要一夜时间，因此存在测定会跨越两天的问题。本发明人等尝试缩短上述现有方法中的一次反应的时间，结果伴随一次反应的反应时间缩短，不仅测定的各试样的吸光度降低，而且一部分试样中，伴随反应时间的缩短，吸光度的降低程度与其它试样中的降低程度不同，因此在以现有方法测定的情况与缩短一次反应的反应时间进行测定的情况中，可知试样间的相对关系（可溶性LR11浓度的高低）不同，即，存在现有方法的测定结果与缩短时间的测定结果的相关性降低的情形。

因此，本发明的课题在于提供对以现有方法测定的试样间的相对关系不产生影响且缩短了测定时间的、更实用的生物试样中可溶性LR11的免疫学测定方法。