[发明专利]孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞及用于有效且划算灭活和使用它们的方法

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2011年3月1日提交的美国临时申请No.61/447,703的权益，其完整内容通过提述并入。

发明领域

本发明总体上涉及生物技术领域，更具体地，涉及德克萨斯侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus texasporus)的胁迫敏感性或孢子化缺陷型菌株、用于德克萨斯侧孢短芽孢杆菌生物体的有效且划算的细胞灭活的方法、及自这类菌株衍生的饲料或水添加剂。

发明背景

本文中引用的任何文件并非承认该文件是现有技术或本文中任何权利要求的可专利性的考虑材料，并且关于任何文件的内容或日期的任何陈述均基于提交时该申请可用的信息，而不构成证实或承认该陈述是正确的。

健康动物或未被病原性生物体(如病原性细菌)感染的动物较快生长并且从每千克饲料取得更多的体重增加。因此，自20世纪40年代以来，抗微生物化合物已被用作家畜中的生长促进剂。通常，抗微生物化合物被以亚治疗剂量或低剂量在饲料中施用。

尽管已长期使用亚治疗剂量的抗微生物化合物来帮助家畜保持健康并更快生长，但最近的报告显示了抗生素的使用与从这些动物生产的肉类上药物抗性细菌的存在之间的联系。因此，欧洲委员会、美国农业部(USDA)以及美国食品和药品管理局(FDA)均已制定了关于将某些抗生素用作生长促进剂的禁令和指南。目前，规则通常聚焦于与用于治疗人类的抗生素相同或类似的抗生素的使用。然而，对使用所有抗生素药物来增强家畜生长的总体性抵制日益增长。此外，有机生成肉类的市场正在扩大，并且要得到有机认证，美国肉类必须来自未经抗生素喂养的动物。因此，目前存在对用于家畜饲料的新型生长增强剂需求。

另外，伴侣动物健康是一个快速增长的市场。经由刺激先天性免疫来保持伴侣动物(例如老龄伴侣动物)的健康对于伴侣动物的保健是一种有吸引力的办法，并且口服投递的免疫刺激剂会是高度有价值的。

德克萨斯侧孢短芽孢杆菌(BT)(例如ATCC PTA-5854)是一种最近鉴定的土壤细菌，其生成一组阳离子非核糖体肽(NRPS peptides)(参见WO2005/074626和WU等2005)。这些来自BT的阳离子肽在体外展现出广谱抗细菌活性，其杀死革兰氏阳性和阴性细菌、真菌和原生动物(WO2005/074626)。

尽管具有体外抗细菌活性，但BT肽似乎缺乏体内抗细菌活性。万古霉素抗性肠球菌在体外对BT肽是高度敏感的。然而，BT肽在明显超出最小抑制浓度的浓度不能使共生的VRE自小鼠肠道去定殖化(decolonize)。

然而，分离的肽被显示了在被用作饲料添加剂时有效预防鸡的大肠杆菌病和沙门氏菌病。另外，还显示了此分离后的肽在鸡中有效促进生长并提高饲料转化。

可能更重要地，BT肽的体内作用似乎不依赖于其体外抗生素活性，因为它在低于其体外最小抑制浓度的浓度时有效预防大肠杆菌和沙门氏菌对鸡的感染(JIANG等2005；KOGUT等2007；KOGUT等2010)。还被注意到的是，在饲喂BT肽的鸡中，血液异嗜白细胞(heterophil)和单核细胞被预备活化(primed for activation)，这指向先天性免疫刺激为可能的作用机理。这些特征使得BT肽成为家畜生产中理想的饲料添加剂和抗生素化合物的替代品。

另外，由于现在还已知先天性免疫在控制病毒性和真菌性感染以及预防非传染病(如肥胖/代谢综合征和2型糖尿病)中起着关键作用(VIJAY-KUMAR等2010)，因此BT先天性免疫调节剂也应在这些治疗领域中具有重要的应用。

然而，BT肽作为饲料添加剂的经济价值严重受限于肽分离的需要，其使生产成本增加至其在经济上不再可行的程度。作为纯化该肽的替代方案，有可能可以将整个生物体(PTA-5854)(如在国际专利公开文本WO2005/074626中讨论的)直接用来生产饲料添加剂。

通常，直接饲喂微生物(DFM)或益生菌(probiotic)菌株需要以活体形式和充足数目到达肠道，这需要菌株在饲料加工和消化期间存活(参见美国专利5,480,641和美国专利公开文本20040247568)。由于饲料颗粒生成通常牵涉足以显著降低存活力的加热，大多数益生菌菌株都经过目标为其对加热和胃中测出的pH条件的抗性的筛选。目前，最稳定的益生菌菌株是芽胞杆菌孢子，因为细菌孢子是热抗性的，并且在长期贮存期间保持存活。