[发明专利]用于组织样品固定的方法

说明书

发明领域

公开的实施方案关注通过醛固定来处理组织样品，如对组织样品的福尔马林固定，从而随后将该样品染色和成像用于病理学判读。

发明背景

福尔马林已在组织学领域中使用超过半个世纪。当在室温使用时，福尔马林扩散到组织切片中并交联蛋白质和核酸，由此中止代谢、保存生物分子并使组织准备好进行石蜡渗透。在实际中，福尔马林固定主要发生在室温或更高的温度。一些小组在稍微升高的温度实施固定，推测是为了提高交联速率。正如加热提高交联速率一样，冷福尔马林显著降低交联速率。出于此原因，组织学家通常在室温或更高的温度实施组织固定。一些小组使用冷甲醛，但仅在特殊化的情况下使用并且并非用于固定组织。例如，一些小组使用冷福尔马林来检查脂质小滴或其它特殊情况。

在暴露不足或过度暴露于福尔马林的组织中观察到数种影响。如果组织样品未用福尔马林处理足够长的一段时间，那么该组织在进行标准组织处理时组织形态学通常非常差。例如，在未适当固定的组织中，随后对乙醇的暴露使细胞结构收缩并压缩细胞核，因为该组织不会有机会形成正确交联的点阵(lattice)。当对固定不足的组织染色时(如用苏木精和曙红(H&E))，在细胞和组织结构之间观察到许多白空间，压缩的细胞核和细胞质丧失，而且样品表现为粉红且苏木精染料不均衡。过久暴露于福尔马林的组织通常对于后续免疫组织化学过程作用不佳，推测是因为核酸和/或蛋白质变性和降解。结果，这些组织的最适抗原修复条件作用不当，因此，组织样品表现为染色不足的。

正确的医学诊断和患者安全性需要在染色前对组织样品的正确固定。因此，肿瘤学家和病理学家已建立用于正确固定组织样品的指南。例如，根据美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology(ASCO))，对于HER2免疫组织化学分析，目前对于中性缓冲福尔马林溶液中的固定时间的指南为至少6小时，优选更久，且长至72小时。开发用于快速固定组织样品的方法对于在显著地降解发生前更好地保存生物学分子和组织形态学，以及尽可能快地为医学专业人员和患者提供准确的测试结合是有利的。

这类方法对于保存翻译后修饰信号尤为重要。蛋白质的翻译后修饰在细胞代谢中起着极其重要的作用。例如，蛋白质的磷酸化调节许多细胞功能如细胞周期控制、复制、转录和翻译。其它修饰如泛素化可以将那些蛋白质引向降解并对细胞功能有着深刻的影响。遗憾地是，当细胞失去对其中一些修饰的控制时，引起细胞增殖和癌症产生。实际上，大多数癌症途径现在整体上与最终导致细胞变成永生化并诊断为癌性的磷酸化级联关联。对于研究者和公司来说，理解癌症中是否存在特定修饰作为诊断特定癌症类型和/或预测治疗结果的方式是极其重要的。

遗憾地是，目前存在的方法(通常需要在室温较长的固定和处理时间)对于保存蛋白质修饰是不佳的。在过去，许多研究者都着手于失去蛋白质修饰信号的问题，例如，中止磷酸酶的作用，例如Millipore(激酶抑制剂混合物)目录号20-116)、Thermo Scientific(中止磷酸酶抑制剂混合物)目录号78420)等。

工业中其它人已开发出快速冷冻方法以中断修饰酶的作用(Lawson等Cytotoxicity effects of cryoprotectants as single-component and cocktail vitrification solutions,2011,vol.62,issue2,pages115-122)。快速冷冻方法一般适用于其中需要保存完整器官用于移植的情况，而且牵涉DMSO或糖。遗憾地是，快速冷冻可以在最初延缓这类酶的作用，但在样品融化时不抑制其作用。这些办法均具有各种局限性。

由于实体组织中大多数磷酸酶抑制剂扩散特性较差或缺乏有效性，因此上述办法主要可用于抑制组织提取物或细胞系中的修饰酶。更大的分子抑制剂如蛋白质会具有极其低的扩散速率。更小的分子如原钒酸盐(orthovanadate)具有更高的扩散速率，但其特异性有限且并非对于所有磷酸酶都极其有效。目前没有通用的、容易执行的、能有效中止实体组织样品中修饰酶作用的方法。如此，本领域中期望开发出在保存组织形态学、蛋白质结构和/或翻译后修饰信号方面提供优秀质量的新的组织固定方法。

发明概述

本发明针对用于固定组织的方法。在典型的实施方案中，该方法在保存组织形态学、蛋白质结构和/或翻译后修饰信号方面提供优秀质量。