[发明专利]修饰型α-葡萄糖苷酶及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及修饰型α-葡萄糖苷酶。更具体而言，涉及修饰型α-葡萄糖苷酶，修饰型α-葡萄糖苷酶的设计方法及制造方法，以及修饰型α-葡萄糖苷酶的用途。本申请主张基于2011年3月16日提出申请的日本专利申请第2011－057386号的优先权，通过参照而援引该专利申请的全部内容。

背景技术

糖水解酶是通过断裂酯键进行分解的酶，但同时大量报道了具有糖转移活性。可称为糖水解酶的代表的α-葡萄糖苷酶也通常具有水解活性(水解反应)和糖转移活性(缩合反应)。α-葡萄糖苷酶广泛存在于从微生物到高等动物以及高等植物的自然界。α-葡萄糖苷酶在产业上也是一种有用的酶，其可用于糖的降解和合成。

通过技术的进步，已经能够实现改变(改良)酶的特性。对于α-葡萄糖苷酶，也已作出多种改变的尝试(例如参照专利文献1～3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2003-88365号公报

专利文献2:日本特开2005-253302号公报

专利文献3:日本特开2009-22204号公报

专利文献4:日本特开2001-046096号公报

发明内容

在产业用途中使用α-葡萄糖苷酶时，由于通常使用水解活性或糖转移活性中的任一个，因此优选不使用的活性低。将α-葡萄糖苷酶用于低聚糖的生产时，水解活性成为阻碍，低聚糖的生产效率降低。因此，本发明的课题在于提供适于低聚糖的生产、糖转移活性占主导的α-葡萄糖苷酶。另外，本发明的课题也在于提供其用途等。

本发明人等以设计提高低聚糖生产能力的新型酶为目的，已经尝试在分子水平上对现有的α-葡萄糖苷酶进行结构改变。具体而言，利用源自人小肠的α-葡萄糖苷酶(人麦芽糖酶-糖化酶)的X射线晶体结构分析结果，进行对计算机模拟以及与四种同源物的比对比较。其结果，确定了构成酶的底物口袋的三个位置的氨基酸。接下来，在黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列上确定了与该氨基酸相当的氨基酸，在此基础上，将突变导入其中。研究得到的修饰体的特性，结果确认酶的特性得到了显著改变(特别是水解活性和糖转移活性的平衡)。在修饰体中，确认了不显示对α-1,4键和α-1,6键的水解活性的酶，对α-1,6键的水解活性显著降低的酶，对α-1,3键和α-1,6键的水解活性大幅降低的酶等。特别值得注意的是，野生型主要是生成在α-1,6位糖转移的低聚糖，与此相对，修饰体(W343M型和W343M/S496T型)仅生成在α-1,4位糖转移的低聚糖。这些事实意味着，以获得适用于低聚糖的生产等的α-葡萄糖苷酶(即，糖转移活性占主导的α-葡萄糖苷酶)为目的进行结构修饰时，作为导入突变的位置，成功确定了的上述氨基酸的位置是有效的。另外，该氨基酸的位置，可以说为了获得显示α-1,4位特异性糖转移活性的独特特性的α-葡萄糖苷酶而作为突变位置是特别有效的。另一方面，成功取得的修饰型α-葡萄糖苷酶其本身在工业生产中有很大的价值。

本发明人等进行了进一步的研究，使用新的方法研究了突变导入位点。具体而言，首先，使用其它计算机模拟软件，构建关于黑曲霉的α-葡萄糖苷酶和构巢曲霉的α-葡萄糖苷酶的立体结构模型。接下来，进行对接模拟分析，进行底物口袋的预测。然后，根据预测结果，检索作为活性中心的氨基酸，确定在各立体结构模型中的位置。然后，在黑曲霉的α-葡萄糖苷酶和构巢曲霉的α-葡萄糖苷酶之间比较氨基酸序列，将构成底物口袋的氨基酸中不一致的氨基酸确定为适于导入突变的氨基酸。接下来，为了确认这些氨基酸是否适合于导入突变(换而言之，是否是有益于结构修饰的氨基酸)，得到对两个氨基酸实际导入突变的修饰体。对得到的各修饰体的特性进行研究，结果发现了显示α1,6位特异性转移活性的修饰体、显示α1,4位特异性转移活性的修饰体。这一事实证明，成功确定了的氨基酸位置对结构修饰是有效的。另一方面，成功获得的修饰型α-葡萄糖苷酶其本身在工业中有很大的价值。

另一方面，进一步研究的结果表明，成功获得的修饰体对低聚糖的生产乃至制造是有用的。值得注意的是，对于显示α1,6位特异性转移活性的修饰体，通过与野生型α-葡萄糖苷酶并用，也能够由具有α1,4键的底物生成低聚糖。