[发明专利]突变分析

权利要求书

1.优先扩增并检测具有至少第一和第二等位基因的基因座的第一等位基因的方法，所述方法包括：

a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：

i)样品，其包含代表至少待扩增基因座的核酸；

ii)寡核苷酸探针，其与第一等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与第二等位基因杂交的解链温度；

iii)用于核酸扩增的寡核苷酸引物对，所述引物在所述寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点与样品中的核酸杂交；其中引物：样品的Tm高于探针：第一等位基因的Tm；

b)将所述反应混合物保持在探针：第一等位基因的Tm与探针：第二等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与第二等位基因杂交；

c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸和退火阶段的温度在探针：第一等位基因的Tm与探针：第二等位基因的Tm之间，以使所述探针在这些阶段与第二等位基因杂交；由此扩增第一等位基因；和

d)在等于或低于探针：第一等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；在更高的温度在等于或低于探针：第二等位基因的Tm检测所述探针与所述样品的杂交；并且比较二者；由此检测所扩增的第一等位基因。

2.权利要求1的方法，其中所述第一等位基因是突变等位基因，并且所述第二等位基因是野生型等位基因。

3.权利要求1或2的方法，其中所述解链阶段的温度高于引物：样品的Tm和探针：第二等位基因的Tm的温度。

4.任意一项前述权利要求的方法，其中所述基因座是多等位基因基因座；即，在所述基因座可能存在野生型等位基因和多于两种突变等位基因。

5.权利要求4的方法，其中选择所述探针以使探针：野生型等位基因的Tm低于探针：任一突变等位基因的Tm。

6.权利要求4或5的方法，其中每种可能的探针：等位基因组合的Tm不同。

7.权利要求6的方法，其中每种组合的Tm差别至少0.1℃，优选至少0.25℃，更优选至少0.5℃，最优选至少0.75℃。

8.任意一项前述权利要求的方法，其中所述探针与第二等位基因的一条链完全互补。

9.任意一项前述权利要求的方法，其中第一等位基因与第二等位基因的序列的不同在于一个或多个点突变。

10.任意一项前述权利要求的方法，其中第一等位基因与第二等位基因序列的不同在于多个单核苷酸多态性(SNPs)。

11.任意一项前述权利要求的方法，其中第一等位基因与第二等位基因序列的不同在于一个或多个缺失和／或插入。

12.任意一项前述权利要求的方法，其中所述探针是DNA。

13.任意一项前述权利要求的方法，其中第一等位基因与第二等位基因之间序列上的差别在所述探针结合的区域内部。

14.任意一项前述权利要求的方法，其中所述探针被标记。

15.任意一项前述权利要求的方法，其中所述探针用荧光标记进行标记，所述荧光标记根据所述探针是否已经与靶标链杂交而产生不同的信号。

16.任意一项前述权利要求的方法，其中所述基因座是多等位基因的，并且检测步骤还包括将反应混合物升温至一个或多个中间温度，并且检测在每个中间温度杂交的探针分子。

17.任意一项前述权利要求的方法，其中第一引物结合探针靶标的3’-方向，而第二引物结合探针靶标的5’-方向。

18.任意一项前述权利要求的方法，其中引物之一以限速量提供，并且所述扩增反应是不对称PCR。

19.任意一项前述权利要求的方法，其中靶基因座选自KRAS、EGFR或BRAF人基因。

20.任意一项前述权利要求的方法，其中靶基因座选自KRAS的密码子12和13，KRAS的密码子61和KRAS的密码子146。

21.权利要求1-19中任一项的方法，其中靶基因座选自EGFR的外显子18，19，20或21。