[发明专利]L-氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生L-氨基酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种有用氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生L-氨基酸的方法，由于还原力增加致使细胞活性提高并缩短细胞培养时间。

背景技术

已知微生物通过发酵作用产生有用产物，需要大量的能量，如ATP(5’-三磷酸腺苷)或还原力，如NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，以增强其生物合成途径。

在微生物的代谢过程中，分解反应所用的NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和合成反应所用的NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)二者在细胞内的平衡是非常重要的。该平衡通过下式所示的NAD磷酸化或NADP的去磷酸化进行控制。

NAD⁺+ATP→NADP⁺+ADP

NADP⁺→NAD⁺+磷酸盐

在大肠杆菌(E.coli)中，已知NAD的磷酸化被nadK(或yfjB)基因编码的NAD激酶(EC2.7.1.23)催化。NAD激酶利用Mg²⁺作为酶反应的辅助因子，并被NADPH和NADH别构抑制。现已知NAD⁺的Km值是2000μM，ATP的Km值是2500μM(Eur.J.Biochem.,(2001)268:4359-4365)。

尽管其在代谢途径中具有明显的重要性，然而，对NADP的去磷酸化的研究却很少。虽然古生菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的NAD激酶同系物，经证明具有NADP磷酸酶活性，然而在真核生物和真细菌中仍然未鉴定到编码具有这类活性的酶的基因。在大肠杆菌中，cysQ基因的产物显示出高NADP和NADPH磷酸酶活性，但纯化的酶的动力学研究表明，它不是所述有机体真正的NADP磷酸酶(Biochem J.,(2007)402:205-218,Biosci.Biotechnol.Biochem.,(2008)72:919-930)。

在许多微生物中发现了NAD激酶活性，对催化活性具有重要意义的NAD-结合位点和NAD激酶的活性位点显示了物种之间高度保守的氨基酸序列。例如，各种微生物，包括革兰氏阳性菌，都显示在螺旋2、4和5(其各自以H2、H4和H5表示)的三级结构预测中显示出高度的同源性(Appl Microbiol Biotechnol(2010)87:583-593)。

NAD激酶产生的NADP最后提供还原力，特别是在大肠杆菌中大量产生有用产物所需的NADP⁺/NADPH是合成代谢反应的必需元素(Biochem J.,(2007)402:205-218)。在大肠杆菌中，NADPH主要通过以下方式产生：1)氧化磷酸戊糖途径，2)TCA循环中的NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶(icd基因)，以及3)转氢酶(pntAB基因)(J Biol Chem.,(2004)279:6613-6619)。

这些反应使用NADP作为底物产生NADPH，从而通过增加NADP的细胞内水平来增加NADPH的水平。因此，为了各种代谢物质的工业化生产，在增加NADP的细胞内水平上做了许多尝试，如，1)通过在大肠杆菌中超表达nadK增加NADPH和胸苷产量(Biotechnol Lett.,(2009)31:19291936)，2)通过在大肠杆菌中超表达nadK增加NADPH和PHB(聚羟基丁酸酯)的产量(Appl Microbiol Biotechnol.,(2009)83:939947)，以及3)与在大肠杆菌中超表达nadK相似，通过在棒状杆菌(Corynebacterium)中超表达ppnK增加赖氨酸产量。以上尝试的关键点在于增加nadK基因的表达。然而，在上述每种情况下，还必须增加诸如ATP的磷酸源，以通过增加NADPH的水平来增加还原力，其源于通过NAD激酶的高表达而增加的NADP水平。