[发明专利]核酸的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用DNA生物芯片的核酸的检测方法等。详细而言，涉及通过利用了应用点凝胶的分子筛效果的凝胶保持型DNA生物芯片的在芯片上的（on-chip）PCR反应进行的核酸的特异性检测方法等。

背景技术

DNA生物芯片是以固定化的DNA为探针与待检测核酸进行杂交反应的工具。

近年来，使用这样的DNA生物芯片进行待检测核酸中的特定的碱基序列的检测，在疾病相关基因的探索、临床诊断等领域中的实用化正在推进。

作为DNA生物芯片，已知例如利用光刻（Photolithography）在2维表面上逐次合成探针的DNA生物芯片（参照专利文献1）、以预先合成的探针在2维表面上进行点样的DNA生物芯片（参照专利文献2）、在树脂板等基板上形成多个槽或贯通孔，在这些槽或孔的内部保持包含DNA的凝胶的DNA生物芯片（参照专利文献3）、在平面基盘上配置包含DNA等的凝胶的点的DNA生物芯片（参照专利文献4）等。本发明人中的一部分也开发了通过下述方法得到的DNA生物芯片：制作在中空纤维的中空部保持有凝胶的中空纤维排列体，在与该排列体的纤维轴交叉的方向上切断（专利文献5参照）。

在以往的DNA生物芯片的使用方法中，由于存在于待检测物中的目标核酸通常为微量，因此需要预先通过T7扩增法、PCR法等对目标核酸进行扩增。此外，对于杂交反应，有时会花费一个晚上。因此，认为有必要使从反应至检测更简化。

为了缩短检测到目标核酸的时间，公开了多种在DNA生物芯片上进行PCR反应的技术。例如，在非专利文献1中公开了下述技术：利用在用规定的氨基硅烷试剂修饰后的玻璃基板的表面上共价结合有成为引物的DNA链的DNA生物芯片，通过固相PCR（Polymerase Chain Reaction）进行DNA扩增。

此外，在非专利文献2中，代替玻璃基板，使用聚（甲基丙烯酸甲酯），使用表面上固定化有DNA片段的DNA生物芯片来评价与规定的DNA链的杂交特性和在PCR样环境下的热稳定性。

作为进一步具体的应用的例子，正在尝试开发非专利文献3～4所示那样的迅速的微生物鉴定方法、单核苷酸多态性的检测方法。

然而，这些方法中仍然存在一些问题。特别是作为在基板上固定化有核酸的DNA生物芯片上的PCR反应的代表性的问题，可以列举下述1）～3）几点等。

1）热循环处理时（PCR反应时），固定化的引物会发生偏移。

2）如果在基板表面上进行PCR反应，则核酸的延伸反应效率低。

3）在PCR反应时，会发生非特异性的检测。

针对这些问题，正在考虑一些解决方案，但需要对基板上进行特殊的化学修饰，不能使用通常的核苷酸（使用取代核苷酸）等，实用性低（参照专利文献6～9）。

还有，除此以外，还公开了不将核酸固定化在基板表面上而是利用凝胶垫（gel pad）的DNA生物芯片技术。已知可以在DNA生物芯片上的凝胶垫内通过扩增反应和个别碱基的延伸进行检测反应（参照非专利文献5）。

使用凝胶的DNA生物芯片（参照专利文献3～5）与在2维表面上固定有探针的DNA生物芯片相比，一个区划所能固定化的探针量增加。因此，可以说是杂交效率（与探针结合的核酸相对于用于杂交的核酸的比例）优异的DNA生物芯片。

上述利用凝胶的DNA生物芯片能够通过作为检测对象的样品（以下，待检测物）在凝胶的多孔质结构中充分扩散并与凝胶中的探针进行反应，获得高杂交效率。然而，在迄今为止已知的凝胶DNA生物芯片中，有时不能使待检测物在凝胶的多孔质结构中充分扩散，仅能用于检测凝胶表面。

为了增大凝胶的多孔质结构的有效细孔径、提高待检测物的扩散等目的，正在进行构成凝胶的单体的种类、单体浓度的研究（参照专利文献10和非专利文献6～9）。例如，在非专利文献6中记载了使用8质量%的丙烯酰胺凝胶的方法，在非专利文献7和8中记载了通过使用5质量%的甲基丙烯酰胺凝胶，能够使最大500碱基长度的DNA杂交。此外，在专利文献10中，通过使用含有2～7质量%的N,N-二甲基丙烯酰胺的凝胶作为在DNA生物芯片中使用的合适的凝胶，能够获得高杂交效率。进一步还已知有利用像N-异丙基丙烯酰胺那样的温度敏感性凝胶的方法（参照非专利文献9）。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第5405783号说明书

专利文献2：美国专利第5601980号说明书

专利文献3：日本特开2000-60554号公报