[发明专利]具有增强的糖类利用的突变微生物体及其制备方法

说明书

发明领域

本发明涉及具有增强的糖类利用的突变微生物体及其制备方法，特别集中于通过遗传工程如在chb操纵子和/或asc操纵子中的启动子置换或yebK基因突变，或者进化适应所获得的突变微生物体。

背景技术

由于石化燃料的耗竭，发展替代能源近年来已成为热点问题。作为替代能源，乙醇可以从纤维素类生物质中生产，其为储存于地球上的可再生的和最丰富的碳源。研究一直集中于通过筛选具有水解纤维素特性的新菌株和改善酶糖化作用和发酵过程来有效分解存在于木质纤维素生物质中的纤维素、半纤维素和木质素。

纤维素燃料生产中的主要步骤包括i)由至少三种酶（如内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶）的协同作用所实现的将植物生物质转化为单一碳水化合物的酶糖化作用和i)将这些糖水化合物转化为增值的燃料的微生物发酵。近来，许多研究集中于同步糖化发酵（SSF），其在同一个反应器中将酶糖化作用和微生物发酵过程相结合，通过降低所述糖化酶的抑制作用和设备成本，显著增强了乙醇生产的效率。由于酶糖化作用是整个过程中最昂贵的步骤之一，研究人员一直在努力增强用于糖化作用的酶的活性或者开发能生产这些酶的新菌株。先进的遗传工程使得能够通过将编码糖化酶的基因引入发酵菌株或者反之生产用于同步糖化发酵的菌株。然而，糖化酶作为异源基因，显示了相当低的表达水平，并且在过表达时它对于细胞生长和代谢也具有负面影响。因此，认为改造（modifying）内源途径的调节比使用异源基因更有利。

大肠杆菌（E.coli）由于其能利用来源于生物质的水解作用的所有糖类的能力而是用于木质纤维素燃料生产的最有效的微生物体之一。然而，由于碳分解代谢物阻遏（CCR），即，抑制参与除了水解产物中首选的那个（如葡萄糖）之外的碳源的分解代谢的酶的生物合成，大肠杆菌的潜能是有限的。因此，糖类如木糖和树胶醛糖直到葡萄糖耗竭才能被代谢。这种对于葡萄糖利用的偏好通过降低生产力而阻碍了发酵过程，并由于未使用的碳源而影响了下游过程。从木质纤维素的水解产物中获得的糖混合物的组分可能不同，但是葡萄糖和木糖将占据它们的重要的部分。因此，依然需要发展具有增强的糖利用和能没有偏好地同时利用糖类的突变体大肠杆菌以改进所述纤维素燃料生产中的成本，效率和可用性。

发明内容

本发明的一个目的是提供具有增强的糖利用的新的突变微生物体。

本发明的另一个目的是提供制备具有增强的糖利用的突变微生物体的方法。

本发明的又一个目的是通过使用上述突变微生物体，提供从生物质中生产生物燃料、生理活性物质、药用材料或工业化学制品的方法。

根据本发明的一个方面，提供通过将选自以下的突变引进野生型微生物体所制备的突变微生物体：

(a)用活性启动子置换chb操纵子的隐蔽启动子;

(b)用活性启动子置换asc操纵子的隐蔽启动子；和

(c)用活性启动子置换chb操纵子和asc操纵子的隐蔽启动子。

根据本发明的另一个方面，提供制备突变微生物体的方法，其包括：

(a)用一个或多个启动子置换chb操纵子和asc操纵子的一个或多个无活性的启动子。

与其它微生物体不同，根据本发明的所述突变微生物体具有增强的利用各种糖类如纤维二糖和木糖的能力，并因此能用于从主要由葡萄糖和木糖所组成的纤维素类生物质中生产生物燃料、生理活性材料、药用材料或工业化学制品。另外，所述突变微生物体的优点在于不需要使用β-葡糖苷酶，其为所述三个水解酶（内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶）之一，能催化所述糖化过程的最后一步。纤维二糖，β-葡糖苷酶的底物，是内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的抑制剂。在上述突变中，纤维二糖将被运输到细胞，这将有助于防止对内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的酶活性的抑制。此外，所述突变微生物体能同时利用各种糖类，导致改善的底物可利用率，CCR去除，缩短的发酵时间和提高的发酵生产率。所述突变也降低了对于加入用于木质纤维素的糖化作用的三种酶之一的需要，并消除了对于发酵戊糖和己糖的单独反应器的需要。

从下面的描述和所附的权利要求，本发明的其它特征和实施方案将是显而易见的。

附图简介

图1图示说明了用活性启动子置换chb操纵子的隐蔽启动子的过程。

图2图示说明了用活性启动子置换asc操纵子的隐蔽启动子的过程。