[发明专利]源自多能干细胞的高功能性肝细胞及其制备方法、以及药物代谢毒性试验方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用多能干细胞制备高功能性肝细胞的方法、以及制备作为其中间产物的源自多能干细胞的原始内胚层及肝前体细胞的方法，还涉及由上述方法制得的源自多能干细胞的原始内胚层、肝前体细胞、高功能性肝细胞，以及使用了高功能性肝细胞的药物代谢及毒性试验。

背景技术

肝脏是生物体中重要的解毒器官，其承担着各种药物的代谢。众所周知，所有药物在向人体给药时，或多或少都会对肝脏造成负担。其程度从轻度的肝功能变化至高度的肝功能不全，涉及范围广泛，但尚没有一种用来事前对其进行预测的方法。

目前，对新开发药物安全性的检验，通过用于获得医药法承认而进行的临床试验（诊治试验）来进行。但实施诊治试验时，还需大量的预算及时间。并且，近年来，还存在着因肝毒性导致处于研究开发中的药物终止开发的项目比例有所增加的问题。另外，还报导有即使在完成诊治试验后上市销售的药物中，也出现了严重肝损伤的病例，从而导致终止销售的事件，并且支付赔偿金等负担也压在制药企业身上。例如，有报导称，作为世界性大型企业的辉瑞（Pfizer）公司开发的抗糖尿病药Rezulin，因肝毒性而终止销售，由此给辉瑞公司造成的损失达数亿美元（非专利文献1）。

另外，药物的肝毒性对每个人的个体差异大，在诊治试验中有时也不能充分的掌握毒性。因此，已上市的药物引发不幸事故而终止销售的例子并不罕见。

因此，在进行诊治试验前，预先通过体外试验，构建可评价药物代谢及毒性的系统，是新药研发事业的当务之急。提供这样的系统，对提高世界水平上的新药研究及促进新物研发事业做出巨大贡献。

目前，作为体外的药物代谢及毒性试验技术，适用：1）使用人肝切片；2）使用人原代培养肝细胞；3）使用人肝细胞株；4）使用人肝细胞微粒体。

其中，人肝切片及人原代培养肝细胞，其批量间或个体间的活性差异大，并且，体外试验中的活性极不稳定，因此使用时的问题较大。

关于人肝细胞株，众所周知其大多不适用于药物代谢及毒性试验。已知唯有HapaRG（非专利文献2）可用于药物代谢及毒性试验，但这是源自特定个人的细胞株，不能评价药物代谢及毒性的个体差异。

人肝细胞微粒体可进行有关药物代谢评价，但其并不是肝细胞本身，只不过是提纯的微粒体组分，不可能进行针对肝细胞本身的毒性评价。并且，配制人肝细胞微粒体，还存在需要大量成本的问题。

从这样的观点来看，对由同时具有无限增殖能力和多能性分化能力的人多能干细胞制备功能性肝细胞技术的开发，可全部解决上述问题。即，通过该技术，能够飞跃性地提高药物代谢及毒性相关评价的质量和效率。

至今已报导有几种由作为人多能干细胞的人胚胎干细胞（ES）及人诱导性多能干细胞（iPS）制备功能性肝细胞的技术，其相关技术也已有报导（专利文献1～3）。

还已报导有可以对主要与肝脏的药物代谢有关的细胞色素P450酶的活性进行检测的技术。但是，现有技术均存在下述致命问题，即在制得的肝细胞中，与未添加药物时相比，细胞色素P450酶的活性充分表达，难以完全检测随着药物添加，细胞色素P450酶的活性上升（非专利文献3～8）。

此外，在现有技术中，不能解决下述重要的技术问题，即，1）培养体系中添加有牛胎儿血清；2）培养体系中共存有源自小鼠的饲养层细胞；3）关于由人多能干细胞开始的分化指向性，细胞株间存在巨大差异（非专利文献9）。

存在牛胎儿血清时，添加到评价体系中的药物吸附到血清成分上，因此不能对药物本身的代谢及毒性进行正确评价。同样，在共存有源自小鼠的细胞的情况下，也存在扰乱药物代谢及毒性测定体系的危险性。另外，与肝细胞制备效率有关的株间差异大，使药物代谢及毒性的测定体系不稳定，因此不能检验细胞株原本的个体差异。

因此，为了恰当且有效地实施药物代谢及毒性试验，当务之急是通过无株间差异的稳定的培养技术，在无血清、无饲养层的环境下，由人多能干细胞开发可对依存于药物添加的细胞色素P450酶活性变化进行检测的功能性干细胞。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2010-75199（用于迅速扩大人胚胎干细胞的培养体系）；

专利文献2：特开2008-212150（源自人胚胎干细胞的胰岛细胞）；

专利文献3：特表2010-529851（多重分化能性/多能性细胞及方法）；

非专利文献

非专利文献1：Nicholls H、今日药物开发（Drug Discovery Today）杂志，第8卷，第1055页；