[发明专利]扫描显微镜和用于物体的光显微成像的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种扫描显微镜，该扫描显微镜具有：用于发射照明光束的照明单元，用于在待成像的样本中生成细长的照明焦点的物镜，以及用于通过改变照明光束入射到物镜的入射光瞳的入射方向而在待照明的样本的目标区域上移动照明焦点的扫描装置。本发明还涉及一种用于样本的光显微成像的方法。

背景技术

从现有技术已知扫描显微镜，该扫描显微镜用于例如荧光显微术中以使用激光激发染料以发射荧光辐射，然后通过检测器检测该荧光辐射以对被研究的样本成像。共焦扫描显微镜特别地用于这个部分的显微术；与常规的光显微镜不同，共焦扫描显微镜不在特定的时间点照明整个样本，而是生成通常衍射限制的光斑，使用该光斑逐点地扫描样本。然后将通过检测器在各个样本点中检测的光信号组合成样本的整体图像。

这种类型的共焦显微镜通常包括作为扫描装置的所谓的点扫描器，点扫描器将通过照明单元传送的照明光束引导到显微镜物镜的入射光瞳中。显微镜物镜将入射到其入射光瞳中的照明光束形成为聚焦的光分布（下文中称为“照明焦点”）。照明焦点的形状和大小取决于物镜的光学性质，特别是数值孔径。如果照明光束居中地且垂直地（即沿着光轴）入射到物镜的入射光瞳，则物镜生成细长的照明焦点，该细长的照明焦点的横向于光轴的尺寸比沿着光轴的尺寸小。然后通过点扫描器（例如以可移动的镜布置的方式）改变照明光束入射到物镜的入射光瞳的入射角度的事实，沿横向于光轴的方向移动照明焦点以扫描样本。

为了通过共焦显微镜进行三维成像，因此必须以上述的方式逐点地扫描样本。由于这是相对复杂的，近来在文献中已经提出在文献中称为选择性平面照明显微术（SPIM）的显微方法。这种方法使用被布置成彼此成90度角的照明物镜和检测物镜工作。与布置在其前方的柱面透镜合作，照明物镜生成沿照明物镜的光轴穿过样本的基本平坦的照明光分布。这种类型的光分布经常还被称为“光薄片（light sheet）”或“光平面”。通过其光轴垂直于光薄片延伸的检测物镜将被这个光薄片照明的样本的目标区域成像到检测表面（例如，CCD）上。如果随后在待成像的样本内移动照明光薄片，则可以使用这个布置获得样本的分层图像。

为了生成最薄的可能的光薄片，照明物镜必须具有相对较高的数值孔径，并且照明物镜的净工作距离必须相对较大以避免与检测物镜碰撞。因此照明物镜的数值孔径限定光薄片的厚度，由此限定沿检测物镜的光轴的光学分辨率。

在WO2010/012980A1中描述的改进的SPIM方法中，使用一个相同的物镜产生照明和检测。为此，偏心地欠照明（underilluminate）物镜的入射光瞳，即，照明光束穿过与光轴横向偏置的入射光瞳的部分。布置在物镜前方的柱面透镜在样本中生成相对于物镜的光轴倾斜的照明光薄片。然后通过物镜依次对被这个光薄片照明的样本的目标区域进行成像。

上述的设备中的每个使用柱面透镜操作以实现样本的期望的倾斜照明。然而，这种柱面透镜的使用具有缺点。例如，这些设备被设计成仅仅用于通过光薄片的倾斜照明，而不能够实现任何与其偏离的使用，例如逐点共焦扫描。还可期望能够改变为倾斜照明生成的光薄片的光强度的空间分布。这对于柱面透镜是不可能的。

DE102005007756A1公开了一种扫描显微镜，其中为了使照明焦点倾斜，将照明光束引导到与光瞳中心偏置的物镜的入射光瞳的子区域上。

DE102007045897A1公开了一种显微镜，其中通过扫描器生成光薄片。