[发明专利]焦磷酸的测定方法以及SNP分型方法

说明书

技术领域

本发明涉及在小型传感器中高灵敏度并且稳定地测定试样溶液中的焦磷酸的方法、以及使用该方法的SNP分型方法。

背景技术

近年来，包括体外诊断药的分子诊断市场快速发展，与基因信息相关的技术正在积极开发。在医疗领域中，通过分析疾病相关基因，实现疾病的分子水平上的治疗。通过使用基因分析的诊断，也能够实现针对每个患者的定制医疗。定制医疗中，进行药物治疗前的体质诊断和感染症的诊断，分析各种基因信息，对每个患者进行适当的治疗和给药。因此，优选这样的诊断，要求POCT(即时检验，Point of Care Testing)性高、迅速、简便的方法。

另外，在基因信息中，基因多态性特别重要。为了使我们的容貌和体型等各种各样，每个人的基因信息也相当大的部分不同。在这些基因信息的差异中，碱基序列的变化以人口的1％以上的频率存在，这被称为基因多态性。这些基因多态性不仅与个人的容貌有关，而且据说与各种基因疾病的原因、体质、药剂应答性、药剂的副作用等相关。目前，正在快速考察这些基因多态性与疾病等的相关性。

该基因多态性中，近年来，SNP(单核苷酸多态性，Single nucleotidepolymorphism)特别受注目。SNP是指在基因信息的碱基序列中仅一个碱基不同的基因多态性。SNP在人类基因组DNA内据称有2～3百万，容易作为基因多态性的标记利用。因此，期待SNP在临床上的应用。目前，作为SNP相关技术，进行了基因组中的SNP的位置鉴定以及SNP与疾病的相关性性等的研究，同时进行了判定SNP部位的碱基的SNP分型技术的开发。

作为SNP分型的技术，有：利用杂交的技术、利用限制性酶的技术、利用连接酶等酶的技术等各种技术。这些技术中，作为最简便的技术，具有：利用引物延长反应的技术。该技术中，通过判定是否引起引物延长反应，进行SNP分型。作为通过利用引物延长反应的SNP分型技术进行的检测方法，考察了使用荧光色素检测实际的DNA的扩增产物的方法、和使用固定化探针电极进行电检测的方法。除了这些方法之外，也考察了检测作为利用DNA聚合酶的核酸合成的副产物的焦磷酸的方法。该方法中，为了检测延长反应的进行的差异，将伴随引物延长反应的进行而生成的焦磷酸转变成ATP，然后，利用荧光素酶反应，测定焦磷酸的量(参照非专利文献1)

另一方面，研究了通过酶反应特异性地检测DNA延长反应的过程中产生的焦磷酸的方法。具有如下方法：使ATP硫酸化酶作用于焦磷酸后，在荧光素酶-荧光素反应中生成光，由此进行检测(专利文献1)。

但是，该方法在进行光检测的方面，具有装置变大型的课题。

另一方面，研究了不使用光检测而对焦磷酸进行电化学检测的方法。

根据专利文献2，公开了如下方法：相含有具有与DNA的SNP序列互补的序列、并且具有SNP部位的DNA探针和、DNA聚合酶(DNAポリメ一ラ一ザ)、脱氧核苷酸的反应体系中供应试样，通过PCR反应，使DNA探针延长，将伴随DNA探针的延长反应而生成的焦磷酸通过焦磷酸酶恢复至无机磷酸，进而，使用包括3-磷酸甘油醛、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、3-磷酸甘油醛脱氢酶、心肌黄酶以及作为电子介质的铁氰化钾的测定系统，最终通过电极测定电流值，由此，对DNA的SNP序列进行分型。阐述了根据该方法，能够在将含有焦磷酸的试样加入到测定系统中后100秒以内判定SNP序列。

该方法中，焦磷酸的测定以及SNP的分型可以通过将电子介质的氧化还原反应进行电化学测定来实现。该方法作为无需光学系统的简便并且高灵敏度的方法公开(专利文献2)。

另外，公开了通过将反应体系的缓冲液成分以及酶等最佳分离并配置，能够使测定高灵敏度化。(专利文献3)

这些检测方法中进行SNP分型时，首先，作为检体，从患者的血液等中提取DNA的模板。此时，为了尽可能减小患者的身体上以及精神上的负担，强烈要求从患者摄取的检体的量尽可能少量就能完成。另外，诊断项目涉及多方面的情况下，由于同时进行多种SNP分型，因此，使用多个传感器元件。此时，强烈期望在一个传感器元件中用于检测的检体的量尽可能少量就能完成。根据这些背景，开发与少量的试样溶液对应的、小型的SNP分型传感器的要求非常强烈。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2002-369698号公报

专利文献2：国际公开第03/078655号

专利文献3：日本专利第4202407号公报

非专利文献