[实用新型]三线态-三线态湮灭的上转换发光显微镜

说明书

技术领域

本实用新型属于光学显微镜技术领域，具体为一种三线态-三线态湮灭的上转换发光显微镜，该显微镜使用普通连续激光器(中心波长在可见区或近红外区)作为激发光源，采用短通分色镜(激发光反射，短波长的发射光透过)收集发射光区的信号。 

背景技术

荧光显微镜是生命科学、医学和材料科学研究中的一个重要工具。其中，基于荧光材料单光子过程的共聚焦荧光显微镜由于其高分辨率、高灵敏度和高放大率等特点，已经成为细胞形态学、(分子)细胞生物学、神经学、药理学、遗传学等领域中不可缺少的研究工具。但它也有固有的缺陷，如样品容易被光漂白，不能完全消除生物样品自发荧光的干扰，使用紫外光和蓝光等短波长的激光作为激发光造成成像深度有限(几十微米)，同时短波长的光容易损伤生物样品。随后发展起来的双光子荧光显微镜采用波长在红外光区的飞秒激光作为激发光源，减小了激发光对生物样品的光损伤，提高了成像深度(几百微米)，同时减弱了非焦面的光漂白。由于现有的荧光材料的双光子吸收性能非常有限，双光子显微镜的激发光源必须使用昂贵的飞秒脉冲激光器(～$200,000)，因此，基于飞秒激光技术的双光子荧光显微镜难以普及。此外，脉冲的飞秒激光具有极高的瞬时功率(峰值功率密度一般大于(10¹¹W/cm²)，所以焦点处的漂白不可避免，限制了双光子荧光显微镜在生物样品长时间连续成像中的使用。 

近年来，稳态激光泵浦的上转换发光材料在生物成像中的应用引起了越来越多研究者的重视。典型的是稀土上转换发光纳米晶材料，和传统的荧光材料相比，这类材料具有特殊的上转换发光性质，即能吸收两个或两个以上低能光子而辐射一个高能光子，通常是将近红外光(主要是980nm)转换成可见光。采用980nm光作为激发光，可以减小激发光对生物样品的损伤，提高成像深度，而使用廉价的稳态激光器(～$2,000)大大降低了仪器造价。另外，由于生物样品内源性荧光物质不能被稳态近红外激光激发，使用这类材料可以完全消除生物样品自发荧光的干扰，但是此方法受限于材料本身稀土离子其低的吸收截面(约为10^-21)和低量子产率(＜1％)，而且980nm光激发容易导致会导致生物样品的辐照部位出现过热效应。 

最近，基于三线态-三线态湮灭(TTA)上转换发光材料引起了人们注意。TTA上转换发光的过程是敏化剂受激于一个长波长低能量的激发光光子后从基态跃迁到激发态，立刻通过系间窜越(ISC)到达激发三线态；再通过敏化剂三线态与受体(Acceptor)三线态间的能量传递(TTET)到达受体的激发三线态；随后，两个受激的受体分子间发生三线态-三线态湮灭(TTA)，使一个受体被激发到能量更高的单线态，最终通过辐射跃迁回到基态实现短波长的发射，完成上转换发光过程。该类TTA上转换发光材料具有吸收截面大(约为10^-18)、激发功率密度低(mW/cm^-2)、量子产率高(可达到15％)、敏化剂和受体(湮灭剂)可选择空间大以及上转换效率高等突出优点。因此，如果能将三线态-三线态湮灭上转换发光材料与显微技术结合起来，发展一种新型的显微镜，则有望解决共聚焦和双光子荧光显微镜存在的一些问题，为生命科学、医学和材料科学研究提供一种新的方法。 

发明内容

本实用新型的目的在于提供一种三线态-三线态湮灭上转换发光显微镜，该显微镜能直接对三线态-三线态湮灭上转换发光性质的材料进行成像，也可以将三线态-三线态湮灭上转换发光材料孵育细胞进行成像。 

本实用新型的技术解决方案是：一种三线态-三线态湮灭上转换发光显微镜，包括物镜和载物台组成的显微镜光学系统，其特征在于：将普通连续波激光器6(中心波长500-1000nm)产生的稳态激光束通过光纤11导入该显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置可翻转的激发二向色镜5(激发光反射，短波长发射光透过)、检流计反射镜4，其中激发二向色镜5与该激光束成45°放置，在垂直于该激光束且穿过该二向色镜的光轴上，同轴地在该二向色镜前方依次放置有共聚焦针孔7、光栅8、狭缝9和光电倍增管检测器10，在检流计反射镜4上方依次放置有物镜3、样品1和载物台2，样品1位于载物台2上。