[发明专利]一种以发夹式DNA为探针的可视化塑料基生物芯片及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物芯片领域，具体地涉及一种以发夹式DNA为探针的可视化塑料基生物芯片及其制备方法和应用。

背景技术

目前已开发的生物芯片大多是将探针分子固定在玻片或硅片等基片上，或是利用探针分子去捕获标记过的靶标物，或是在捕获无标记的靶标物之后再额外加入信号报道单元（即形成夹心式的传感构型）（例如J.Am.Chem.Soc.2001,123:5194-5205.），来实现对靶标物的信号响应。然而，无论是采用标记靶标物，还是采用额外加入信号报道单元，均增加了生物芯片在操作过程中的复杂性和对专业仪器的依赖性，大大降低了生物芯片的可实用性。把所有修饰以及信号单元都集中在探针分子上，即采用分子信标（经功能单元修饰的探针分子）作为探针，是实现对靶标物便捷、灵敏检测的一种可行性途径。

分子信标（beacon）通常是指一段具有特殊碱基序列的双标记核苷酸链（DNA），由于其链两端的碱基序列互补配对，从而形成茎环相连的发夹状结构（hairpin)（Nat.Biotechnol.,1996,14:303-308.）。通常在分子信标一端修饰上荧光基团，另一端修饰上荧光猝灭基团。当DNA呈发夹状折叠时，两端修饰基团相距较近，发生荧光猝灭而没有信号；当加入靶标物后，分子信标构型发生翻转即发夹结构被打开，荧光基团与猝灭基团距离变远，从而产生荧光信号。相对于传统的直链DNA探针，分子信标以操作简单、无需对靶标物标记、灵敏度高等特点，在液相生物分析与检测领域得到了广泛的应用。

尽管如此，将分子信标固定在塑料基片上，利用其与靶标物的特异性结合来诱导构型转变，进而实现对靶标物的可视化灵敏检测，仍然存在诸多挑战。如要兼顾探针发夹结构的稳定性和探针中功能片段与靶标物的结合强度，还需兼顾信号标记单元在探针构型翻转前后与基片间距离的远近。其次，分子信标探针在塑料基片上的密度、其构型的稳定性（与温度及缓冲液盐离子浓度等有关）也需要系统研究与反复的优化。再次，针对不同靶标物，为了降低背景信号，需要优化信号单元与探针链间的连接长度和选择合适的封闭溶液。目前，将分子信标固定在塑料基片表面上进行可视化的分析与检测尚未见报道。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种以发夹式DNA为探针的可视化塑料基生物芯片。

本发明的再一目的是提供一种发夹式DNA塑料基生物芯片的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种应用发夹式DNA塑料基生物芯片的应用。

进行分子信标的研究和应用时，茎干区和环状区的序列设计是关键所在。过长的茎干会使发夹结构过于稳定而给出假阴性结果，过短则使发夹结构不稳定，容易给出假阳性结果。就序列碱基来说，应该使茎干区稳定状态适当，而环状区则应该避免任何可能的二级结构，否则分子信标茎一环结构将受到影响。在本发明中我们主要对探针末端（生物素修饰的一端）链长、分子信标探针茎干区互补配对的碱基个数进行了优化。

此外，分子信标探针的浓度，缓冲液的PH值、镁离子的浓度，封闭液、封闭液的浓度对分子信标探针的固定、发夹结构的形成、背景信号的降低和目标信号的增强有重要的影响。本发明中我们主要对分子信标探针的浓度、首次封闭液和封闭液的浓度进行了优化。

根据本发明的发夹式DNA塑料基生物芯片包括：

1）透明的塑料基片（PC，PMMA，PET等）；

2）固定在上述基片上呈阵列分布的DNA信标探针(hairpin DNA)；所述分子信标探针是一种呈发夹结构的双标记核苷酸链，其一端修饰联接基团（例如，氨基、羟基、醛基等）以固定在基片上，其中联接基团与探针链通过6-12碳的烷基链相连；另一端修饰信号报道基团，其中探针链端与信号报道基团通过6-18碳的烷基链相连，以显示识别反应的发生；另外，探针链两端部分碱基（5-10对）互补配对以形成茎（stem）-环（loop）相连的发夹构型。当该型芯片与靶标物（target）接触时,靶标物能诱导DNA探针发生构型转变，从而产生响应信号。若该型芯片生物芯片进一步遭受银染色或酶催化底物显影处理，即可获得可视化的目标信号。

根据本发明的发夹式DNA塑料基生物芯片，所述信号报道基团为金纳米粒子或铂纳米粒子（1-20nm）、生物素、酶（例如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP）以及葡萄糖氧化酶（GOD））等。

根据本发明的发夹式DNA塑料基生物芯片的制备方法包括以下步骤：

1）塑料基片表面活化处理；通过光学或化学方法在基片表面产生高密度活性基团（例如羧基、巯基、羟基、醛基、氨基等）；