[发明专利]鹿鞭毛细管电泳DNA指纹图谱及建立方法和应用无效
申请号: | 201210593298.2 | 申请日: | 2012-12-22 |
公开(公告)号: | CN103122380A | 公开(公告)日: | 2013-05-29 |
发明(设计)人: | 苑广信;李明成;刘桐辉;王淼;张丽华;李洪宇;傅桂莲;王冰梅 | 申请(专利权)人: | 北华大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68 |
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地址: | 132013 吉林*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 鞭毛 细管 电泳 dna 指纹 图谱 建立 方法 应用 | ||
技术领域
本发明涉及中药材鉴定技术,具体地说是一种鹿鞭毛细管电泳DNA指纹图谱及建立方法和应用。
背景技术
鹿鞭又名鹿肾,为名贵中药材,是鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck和马鹿Cervuselaphus Linnaeus雄性的阴茎和睾丸的干燥品。具有补肾、壮阳、益精、治腰膝酸痛、肾虚耳聋、阳痿、宫冷不孕之功效。由于价格昂贵,需求量大,市场上率见以驯鹿鞭、牦牛鞭和驴鞭等充伪现象。
目前,鹿鞭的鉴别主要依据外观性状,显微鉴别和理化性质等进行鉴别。这些方法能在一定程度上对鹿鞭的鉴别和质量评价提供依据,但需要依靠丰富的经验,主观性强。此外,鹿鞭在干燥及加工过程中性状可塑性很强,导致性状鉴别结果不准确,难以满足快速、准确的鉴别要求。因此,为鹿鞭的真伪鉴定建立一种简便、准确、实用的方法尤为重要。
随着现代分子生物技术的发展,DNA分析技术不断渗透到中药鉴定领域,推动了中药鉴定研究的发展。DNA分子作为遗传信息的直接载体,不受外界环境因素和个体发育的影响,具有遗传稳定性和化学稳定性。纵观近年来这一领域的研究成果,发现DNA指纹图谱非常适用于中药(尤其名贵中药材)易混品种鉴定。该类技术具有种质特异性,能够建立用于鉴定生物个体之间差异的电泳图谱。目前,广泛应用于构建DNA指纹图谱的分子标记方法大致可分为3类:首先以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术,其中代表技术为限制性片段长度多态性(RFLP)分析;第2类是以电泳技术和PCR技术为核心的分析标记技术,实际使用较多的代表技术为:随机扩增DNA多态性(RAPD)分析、简单序列重复间区标记技术(ISSR)和扩增片段长度多态性(SFLP)分析。第3类是以DNA序列为核心的分析标记技术,其代表技术为细胞色素b(Cyt b)测序技术。由于RFLP和DNA测序技术操作复杂、实验周期长,ISSR需要了解实验材料的遗传信息,AFLP被申请专利保护,因此这些技术在实际应用上均存在一定限制。
而由于RAPD技术具有如下优点:
①无需专业设计RAPD扩增引物,不需要预先了解基因组构成,引物可随机合成和选定。
②RAPD引物量大,且在整个基因组中的结合位点多,可以对基因组进行地毯式多态性分析、检测基因组间微小差距。
③RAPD技术简单易行,省时省力,RAPD易于程序化,可引入计算机系统。
④RAPD所用样品量少,且对DNA纯度要求不高,适合于鉴别干燥药材。
以上优点保证了RAPD技术被广泛应用于各中药品种的鉴定。但RAPD技术目前仍存在几点缺陷:
①由于RAPD对反应条件很敏感,因此实验条件需要求严格,以保证实验重复性。
②目前RAPD产物分析主要采用传统平板凝胶电泳技术,方法虽然成熟,但是耗时、费力、非自动化并且分辨率和灵敏度均较低,很大程度上掩盖了RAPD产物的多态性,严重制约了RAPD技术在构建物种DNA指纹图谱方面的应用。
③目前利用RAPD技术对中药进行真伪鉴别时,往往人为的在凝胶图谱中选择几条具有代表性的扩增条带,依据这些“标准”条带来进行定性鉴别。这种方法表面上使结果分析简单化,但由于人为的对扩增条带进行取舍,降低了扩增产物的多态性,同时降低了分析结果的客观性。
高效毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术,由于其具有快速、价廉、分离效能高、样品用量少、抗污染等优点,被广泛应用于蛋白质、核酸、DNA、氨基酸等生物样品分析中。CE可以满足RAPD扩增产物对高分离度的要求,体现扩增结果的多态性;CE可明显缩短RAPD扩增产物分析时间,省时省力;CE分析结果可采用统计学方法处理,更适合RAPD扩增这种复杂结果的准确分析。因此,CE作为一种高效分离检测技术非常适用于RAPD扩增产物的分析,二者结合可有效解决RAPD技术的缺陷(缺乏合适的检测手段,重复性和稳定性较差)。本发明将高效毛细管电泳技术和和随机扩增DNA多态性分析(RAPD)技术相结合,并用于中药材鹿鞭的鉴定中,建立了鹿鞭毛细管电泳DNA指纹图谱。本方法分辨率高、灵敏度高、操作简便、快速、安全、结果准确,能够用于鹿鞭样品的鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于药材真伪鉴别的鹿鞭毛细管电泳DNA指纹图谱及建立方法和应用,以解决现有技术的缺陷。本方法分辨率高、灵敏度高、操作简便、快速、安全、结果准确,能够用于鹿鞭样品的鉴定。
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