[发明专利]一种曼氏无针乌贼微卫星位点及引物

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种曼氏无针乌贼微卫星位点及引物。

背景技术

微卫星DNA (Microsatellite)：又称为短串联重复序列 (short tandem repeats，STRs) 或简单序列重复 (simple sequence repeats，SSRs)。它是以1- 6个碱基的短核苷酸为基本单位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计一对特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态性丰富，遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR 扩增，所需 DNA 数量极少，对 DNA 质量要求不高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图谱构建、功能基因定位、分子标记辅助育种 (Marker-assisted Selection，MAS) 等领域。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni，Rochebrune) 俗称墨鱼、日本无针乌贼，隶属软体动物门(Mollusca) 、头足纲(Cephalopoda) 、二鳃亚纲(Dibranchia)、十腕目(Decapoda)、乌贼超科(Sepiacea)、乌贼科(Sepiidae)、无针乌贼属(Sepiella)，是我国近海广布性种，曾是我国四大海产渔业（大黄鱼、小黄鱼、墨鱼与带鱼）之一，以舟山渔场产量最大，在我国沿海知名度很高。由于过度捕捞，至上世纪80年代，乌贼的资源量锐减，渔讯消失，趋于濒危状态。为了加强对曼氏无针乌贼资源的保护，近年来其增殖放流及产卵场的保护和修复工作逐步展开，迫切需要对资源现状及增殖放流的效果进行遗传学评估以制定合理的放流措施。微卫星分子标记在物种的群体遗传学及放流增殖效果评估方面具有广阔的应用前景，因此，选用有效的微卫星标记对于曼氏无针乌贼资源的保护和合理开发利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供曼氏无针乌贼微卫星位点及多态性引物，即提供6个曼氏无针乌贼的微卫星位点，以及相应的多态性引物，为曼氏无针乌贼的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育种技术提供有效的工具。

本发明一个方面提供6个微卫星位点，其核酸序列分别为SEQ ID NO:1-6。

本发明还提供上述核酸序列的互补序列。

本发明还提供从上述6个微卫星位点上设计的引物对，其中序列为SEQ ID NO：1的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。

序列为SEQ ID NO：2的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。

序列为SEQ ID NO：3的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12。

序列为SEQ ID NO：4的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14。

序列为SEQ ID NO：5的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16。

序列为SEQ ID NO：6的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18。

本发明的微卫星多态性引物用于曼氏无针乌贼种群遗传多样性的检测，包括如下步骤：

1）基因组DNA的提取：采用苯酚-氯仿法抽提曼氏无针乌贼肌肉组织的基因组DNA；

2）微卫星PCR扩增：采用设计的引物，曼氏无针乌贼基因组DNA为模板进行PCR，获得曼氏无针乌贼个体微卫星扩增产物；

3）电泳检测扩增产物：采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测微卫星扩增产物；

4）遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP 4.0.10计算遗传多样性参数。