[发明专利]一种四环素产生菌原生质体的制备与再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物原生质体制备与再生方法，具体地说是一种四环素产生菌原生质体制备与再生的方法。

背景技术

四环素（Tetracycline，TC）是一种抑制细菌蛋白质合成的广谱抗生素，因其分子结构含四并苯基本骨架而得名，主要用于各种革兰氏阳性球菌和革兰氏阳性杆菌的感染治疗，在医药、畜牧和农业方面均有广泛的用途。我国从20世纪60年代开始工业化生产四环素，至今已有五十多年的历史。四环素产生菌为放线菌中的链霉菌属（Streptomyces），目前，其优良菌种的选育主要采用传统的育种方法，菌种经过长期的人工诱变育种和自然分离，已形成较高的生产能力。但是菌种经过多种物理和化学因子诱发突变之后，不仅遗传背景变得相当复杂，而且对诱变剂的耐受性也大大的增强了，因此，利用传统的育种方法继续提高四环素的产量已经越来越困难，菌种诱变率低、选育效果差是困扰四环素菌种选育工作的主要问题。

原生质体融合技术是20世纪70年代发展起来的一种新的遗传育种手段，该育种技术的优点是去除了细胞壁的障碍，采用物理因子或化学因子对原生质体进行诱变处理，能够提高原生质体的突变频率，在再生菌落中筛选突变株，可以有效提高优良菌种的选育效率，利用原生质体技术来培育工业新菌株已受到国内外微生物育种工作者的普遍重视。在探索四环素原生质体育种技术的过程中，存在的最大问题是没有关于四环类抗生素原生质体制备和再生的方法可以借鉴，原生质体制备成功后细胞壁的重建过程非常困难，或者是无法产生原生质体的再生菌落，或者是只生长基内菌丝和极少量气生菌丝，不能产生孢子丝，造成菌落不能进行正常的传代。由此极大地限制了原生质技术在四环素菌种选育工作中的应用。

发明内容

本发明的目的就是提供一种四环素产生菌原生质体的制备、再生方法，以解决现有传统育种技术中存在的菌种诱变率低及选育效果差的问题。

本发明是这样实现的：

本发明所提供的四环素产生菌原生质体制备与再生的方法，它包括如下步骤：

a、制备四环素斜面培养基：称取小麦麸皮3.0-3.5g，硫酸镁0.004-0.006g，磷酸氢二钾0.01-0.12g，磷酸氢二铵0.013-0.015g，琼脂粉1.3-1.5g，加蒸馏水至100ml；120-124℃条件下湿热灭菌30分钟。斜面培养基装量60ml/茄子瓶。

b、制备孢子悬浮液：将四环素产生菌接种于斜面培养基上，于33-36℃条件下培养96小时左右，长出外观质量合格的斜面孢子。在无菌条件下加入无菌蒸馏水或菌丝体培养基制成孢子悬浮液，使孢子液浓度在1×10⁸/ml以上。

c、制备菌丝体培养基：称取葡萄糖0.8-1.2g，蛋白胨0.3-0.5g，酵母膏0.3-0.5g，磷酸二氢钾0.1-0.2g，硫酸镁0.03-0.05g，磷酸氢二钾0.3-0.4g，甘氨酸0.2-1g，加水至100ml；120-124℃湿热灭菌30分钟。

d、制备再生培养基：称取面粉2-4g，蛋白胨0.3-0.5g，磷酸二氢钾0.05-0.10g，碳酸钙0.1-0.4g，蔗糖0-11g，琼脂1.0-2.5g，加水至100ml；120-124℃℃湿热灭菌30分钟后制成平板培养基。

e、培养菌丝体：

将四环素孢子悬浮液接种于c步所述菌丝体培养基中，27℃-33℃条件下，震荡培养22-32小时，离心弃去上清液，得到菌丝体；

f、酶解细胞壁：

将e步骤所得菌丝体中加入稳定液，离心洗涤2-4次，加入溶菌酶溶液，使酶的作用浓度为2mg/ml-6mg/ml，30℃-37℃酶解1-3小时，得到酶解液；

g、分离原生质体：

酶解液经离心先去除沉淀（离心时的优选条件为500转/分，2-4分钟）。然后再将上清液离心（上清液离心的优选条件为转速3500-8000转/分，时间10-15分钟），获得原生质体；

h、原生质体再生：

将g步骤所得的原生质体用稳定液离心洗涤2-4次，加入一定量的稳定液制成原生质体悬浮液，血球计数板计数后，用稳定液对原生质体悬浮液进行梯度稀释，采用夹层法培养于再生培养基上，33℃-36℃条件下培养5-7天后形成再生菌落。

本发明所述四环素产生菌可选用菌种编号CPCC220020的菌种。

本发明所述的稳定液选择高浓度蔗糖渗透液，其中蔗糖浓度以10-11%为宜。