[发明专利]一种离体高效构建多拷贝毕赤酵母表达载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及离体高效构建多拷贝毕赤酵母表达载体的方法，属于基因工程技术领域。 

背景技术

巴斯德毕赤酵母表达系统起源于19世纪80年代，相对较晚,但后期发展快速。巴斯德毕赤酵母已经成为了一种成熟的外源蛋白表达系统。 

常用的巴斯德毕赤酵母表达载体含有一些共同的特征。很多载体都选择巴斯德毕赤酵母HIS4基因作为选择性标记。来源于巴斯德毕赤酵母基因组AOX1基因的3’端的AOX1 3’侧翼序列，也存在于很多载体中，并可作为外源基因整合和插入的位点。使用最多的是来自酿酒酵母MFα-SS前导肽编码序列。 

在巴斯德毕赤酵母表达系统中，乙醇氧化酶（AOX）启动子是使用最广泛的。MFα-SS是使用最广泛的信号序列，在翻译后，MFα-SS信号肽被肽酶识别，并被kex2蛋白酶所切除，从而形成成熟的蛋白质。影响毕赤酵母表达系统分泌蛋白质的含量主要有几个因素：（1）启动子，（2）信号肽，（3）表达盒式结构在宿主菌中整合的拷贝数。所以目前的毕赤酵母表达系统的优化主要从这几个方面着手。 

据报道，提高目标基因盒式结构在宿主菌中整合的拷贝数是增加单个细胞中重组蛋白的表达量的最有效的方法。筛选高拷贝菌株通常有2种方法：1）依赖于限制性内切酶，人工体外构建高拷贝重组质粒；2）选用含有抗性筛选标记的表达载体。使用“生物砖”技术（“Biobrick”），利用简单的手段，从最简单的组件开始建立，最终可以构建大规模的复杂多拷贝系统。 

目前使用最广泛的毕赤酵母表达载体之一是pPIC9K载体(Invitrogen公司销售)，该载体目前虽已成功表达了很多外源蛋白，但它还有其自身的局限性。 

1）克隆方式复杂。目的基因克隆到该载体上都是用的依赖于限制性内切酶酶切和连接酶酶连的克隆方式，该载体的多克隆位点处只有四个酶切位点，其中两个酶切位点并不常用，这使得克隆外源片段时可供选择的插入位点大为减少；并且如果以PCR产物克隆目的基因， 必须要考虑到目的片段上是否有该限制性内切酶酶切位点，由于该载体上的酶切位点有限，所以对于不同的基因克隆到载体上就会受到限制，这样可能就会造成很多基因内部也包含有克隆所需的酶切位点，导致目的基因克隆到该载体上要突变其基因内部的一些酶切位点，从而使克隆步骤复杂化； 

2）生物安全性不够。目的基因克隆到pPIC9K载体上之后，线性化的重组质粒以插入的方式同源重组到巴斯德毕赤酵母宿主基因组中，由于pPIC9K上的抗氨苄青霉素的表达盒式元件“Amp” 和在大肠杆菌中用于复制起始的元件“Ori”会随着目的基因表达盒一起整合到酵母基因组上去，这样使得构建的基因工程菌具有一定抗性，并且拷贝数越高，抗性就越强，如果抗性基因不慎泄露到环境中，就可能会增加环境生物安全性的风险，并且拷贝数越高，抗性就越强；3）线性化片段转化的效率低。传统的pPIC9K载体构建的重组质粒用SalI线性化之后，由于“Amp+Ori”元件随着目的基因表达盒一起整合到酵母基因组上去，线性片段太大，转化效率就大大降低；4）pPIC9K载体采用的是AOX1启动子，虽然调控方式很严谨，但是该启动子驱动mRNA的转录水平还不是很高，还有待进一步增强启动子的活性；5）pPIC9K载体使用的信号序列是来自编码酿酒酵母MFα-SS序列的DNA序列。酿酒酵母和毕赤酵母同属于酵母，但是在密码子偏爱性方面仍存在一定的差距，使之对外源蛋白的表达和分泌可能没有达到最佳的效果；6）由于存在基因的剂量效应，大多数基因，随着拷贝数的增加，目的基因的转录也大为提高，从而有可能提高目的基因的表达量。由于目前传统的毕赤酵母表达载体多拷贝出现的频率很低，自然状态下，如果转入巴斯德毕赤酵母的表达载体是单拷贝，转化后出现多拷贝整合的概率约为1-10%，并且拷贝数不可控(Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.[J] FEMS Microbiol Rev. 2000; 24(1): 45-66)，具有偶然性，体内方法可筛选插入多拷贝外源基因的His+转化子，但是效率很低，要筛选足够量的转化子才能得到高拷贝的转化子，这样大大提高了筛选高拷贝菌株的成本和工作量。因为pPIC9K载体含有细菌来源的抗卡那抗生素的表达盒单元(“kan”)，赋予毕赤酵母G418抗性，所以现在一般用的都是用不同的G418抗性水平来筛选高拷贝转化子，但是这种筛选方法有缺陷：一是会造成假阴性，因为新转化的细胞需要时间表达足够量的抗G418的代谢产物，由于酵母生长比细菌慢得多，大部分重组酵母在积累足够多的抗G418的代谢产物以抵抗平板上抗生素之前就已经被杀死了；二是由于随着拷贝数的增加，酵母基因组上整合的“kan”的拷贝数也增加，如果“kan”泄露到环境中，可能会给环境的生物安全性带来一定的风险。