[发明专利]基于DNA hairpin和RCA的核酸检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分子检测领域，具体涉及一种基于DNA hairpin和滚环扩增(RCA)实现核酸分子快速、高灵敏检测的方法。 

背景技术

滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在特殊的DNA聚合酶(phi 29 DNA聚合酶)催化下将dNTPs转变成单链DNA。其线性扩增倍数为10⁵，指数化扩增能力大于10⁹，实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。比如Juan Hu等人(Juan Hu，Chun-yang Zhang；Sensitive detection of nucleicacids with rolling circle amplification and surface-enhanced raman scatteringspectroscopy；Anal.Chem.2010，82，8991-8997)利用RCA实现了高灵敏度的核酸检测，但是其中设计过多分子探针设计，存在两步酶促反应，增加了检测的复杂性和检测成本。 

DNA hairpin是指一段单链DNA分子末端局部互补配对形成的一种特定分子结构，分为茎部(hairpin)和环部(loop)两个部分。DNA hairpin的茎-环结构在某些特殊的情况下可以打开，比如当另一段单链DNA与环部互补配对结合后，其茎-环结构就会打开。基于这种特性，多种核酸检测方法被提出。比如Gwo-bin Lee等人(Yi-chih Su，et al；Multiple pathogen detection for poultry byultilizing integrated microfluidic system；MicroTAS’2012)利用在DNA hairpin的5’端和3’端分别修饰上荧光分子和荧光猝灭分子的方法来检测病原体DNA。但是荧光分子和荧光猝灭分子修饰价格昂贵，作为分子检测的成本过高，不利于检测方法推广使用。 

发明内容

本发明的目的在于利用DNA hairpin的环部与特定单链DNA或RNA互补配 对结合后其茎部会打开，以及目标核酸分子的量不同，打开的茎-环结构就不同的特性，将DNA hairpin的茎部碱基序列设计为滚环扩增的引物，以简化滚环扩增用于核酸检测的步骤，以实现简单，低成本，高灵敏度的核酸检测。 

为实现上述目的，本发明采用以下步骤： 

1)将DNA hairpin修饰到固体载体上； 

2)加入环状DNA、酶、BSA、扩增原料； 

3)加入待测目标核酸分子，进行滚环扩增； 

4)扩增后对目标核酸分子进行定量检测。 

步骤1)中，所述固体载体包括纳米颗粒。 

步骤1)中，所述DNA hairpin，包括5’端连接分子修饰，环部，茎部。 

进一步地，所述5’端连接分子为生物素(biotin)，通过与固体载体表面链霉亲和素(streptavidin)结合，将DNA hairpin修饰固定到载体表面； 

进一步地，所述环部碱基设计成能与目标核酸分子互补配对的碱基； 

进一步地，所述茎部的3’端碱基设计成能与滚环扩增的环状DNA互补配对的碱基，作为滚环扩增的引物； 

步骤2)中，所述环状DNA为单链环状DNA，为滚环扩增的模板。 

步骤2)中，所述酶为恒温酶，包括phi 29 DNA聚合酶，RNA聚合酶。 

步骤2)中，当检测的目标分子是单链DNA时，扩增原料为四种脱氧核糖核苷酸，当检测的目标分子是RNA时，扩增的原料为四种核糖核苷酸。 

步骤3)中，所述目标核酸分子包括单链DNA或RNA。 

本发明的核酸检测方法利用了DNA hairpin结构的可逆性和RCA的快速，简易性，提供了一种简易、高灵敏度的核酸分子检测方法，其优点和积极效果如下： 

a)利用DNA hairpin作为RCA的检测探针，简化了用RCA检测分子的流程，减少了酶等生物试剂的使用，降低了检测成本； 

b)利用了DNA hairpin结构的可逆性，同时保留了RCA用于核酸检测高灵敏度等的优点； 

c)各种检测原料包括DNA hairpin，环状DNA，酶，扩增原料等均可在市场上买到，适于广泛推广使用。