[发明专利]建立人卵巢癌动物模型的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法及模型建立方法。

背景技术

卵巢癌预后差，是导致女性因生殖系统恶性肿瘤病死率最高的癌症，因卵巢位于盆腔内位置深，发生肿瘤时无典型症状，确诊时60%～70%已属晚期，肿块已固定，出现腹水，广泛盆腔转移且卵巢癌化疗病情缓解后容易复发，5年生存率只有20%～30%。相比其他妇科肿瘤，卵巢癌早期诊断和治疗近来并无重大进展，患者生预后无明显转变。因此寻找和探索用于卵巢癌诊断和治疗的新技术,新方法变得非常重要。

动物模型是对人体肿瘤进行体内研究必不可少的工具，在建立新的治疗方法时尤为重要。目前建立的人卵巢癌裸鼠转移瘤模型大多来源于肿瘤细胞株，由于肿瘤细胞在体外培养，离开了体内环境，经过长期传代培养，消除了体内细胞与细胞之间的相互作用，不能完整模拟卵巢癌的生物学行为和自然生长过程，也会导致肿瘤细胞、生物学特性和遗传学特征的改变，由其来源的小鼠肿瘤模型的自然病程和病理类型及肿瘤表型自然不能完全代表临床患者，进而影响了实验结果的准确性和结论的可靠性，以及用于评估临床疗效与安全的权威性。

国内外也有把患者癌组织直接接种到裸鼠皮下或腹腔内并形成肿瘤模型的报道。皮下接种的肿瘤虽然容易观测，但未发现有其他部位的转移灶，尤其是腹腔（广泛腹腔播散是晚期卵巢癌临床特点之一），其应用价值受到限制。已报道的肿瘤腹腔内接种模型，虽然有腹腔内的癌灶扩散，但其卵巢本身并没有发现肿瘤转移灶，也有一定局限。

因此，当前本领域急需一种能克服现有技术缺点的建立一种能真正重现临床肿瘤发生发展的人卵巢癌的动物模型的方法。

发明内容

本发明的目的是提供人卵巢癌的动物模型建立方法。

本发明提供了建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法，包括如下步骤：

1）人卵巢癌细胞冻存：患者腹水置于无菌离心管中，300g离心5min，用冻存液重悬，-80℃保存24h后转入液氮中长期保存；

2）人卵巢癌冻存细胞复苏：取冻存的肿瘤细胞在37℃水浴中解冻，解冻时间≤30s，用高糖DMEM培养基（糖含量为4.5g/L）洗涤细胞1次，300g离心5min，PBS（磷酸盐缓冲液）重悬并调整细胞浓度至1~2×10⁷/mL；

前述所有操作均在无菌条件完成。

其中，所述的冻存液为含8%v/v DMSO（二甲基亚砜）的胎牛血清。

进一步的，步骤2）中PBS重悬并调整细胞浓度至10⁷/mL。

在操作开始前，患者腹水应置于冰上。

本发明提供了建立人卵巢癌动物模型的方法，包括如下步骤：在无菌条件下，将经前述方法处理后的组织材料接种至小鼠腹部；接种后第30周开始传代，第2代传代时间为92~98天，第3代后生长周期逐渐缩短并稳定，第3~6代传代时间为36~42天。

其中，上述方法中的接种采用注射器，行腹腔注射完成。

本发明的建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法也可以用于在模型建立后传代后肿瘤组织的处理。

本发明所使用的小鼠为NOD/SCID小鼠，鼠龄4周，体重15~20克，雌性，饲养在四川大学实验动物中心SPF（无特定病原体）屏障系统内，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

本发明的有益效果：

本发明方法通过将组织材料进行处理后再建立人卵巢癌动物模型，克服了目前人卵巢癌动物模型的种种问题，尤其是卵巢未见癌灶的难题。建立起了能稳定传代的人卵巢癌NOD/SCID小鼠动物模型，传代时间稳定，且每代的一次接种成功率达100%，鉴定结果迅速准确，远优于现有技术。经实验证明，使用本发明方法所建立的NOD/SCID鼠移植瘤模型再现了人卵巢癌的重要生物学特征，从病理组织学、免疫表型、分子生物学特征以及分子遗传学等方面均与供体病例基本一致，生长周期稳定。不仅解决了该肿瘤研究材料异质性的问题，同时由于模拟了该肿瘤在人体内生长情况，对该肿瘤发病的分子机制、肿瘤的演进的研究、治疗手段的探索、治疗药物的筛选及评价都有重要的实用价值，具有很好的应用前景。

附图说明

图1~5为人卵巢癌腹水瘤模型形态学观察

图1、右侧为荷瘤鼠，可见腹部明显胀大，左边为正常鼠

图2、腹腔内充满淡黄色腹水

图3、横膈及肝表面有转移结节

图4、肠系膜表面有转移结节

图5、腹膜上有转移结节

图6、荷瘤鼠生殖系统-子宫，输卵管，卵巢（右侧）与正常小鼠（左侧）比较