[发明专利]植物药材鉴别方法及其数据库以及引子对

说明书

技术领域

本发明系关于一种鉴别一植物药材种类的方法，且特别关于一种鉴别一植物药材种类的方法，其结合了使用特别设计之引子所进行的聚合酶链锁反应以及高解析双股分离动力分析(high-resolution melting analysis,HRMA)，且此鉴别方法具有可快速并准确鉴别植物药材的优点。 

背景技术

市售药材基原混杂，常有混用、代用与误用的情形，然而过去物种鉴定都必须由序列解析，并经由公开数据库搜寻比对才能完成鉴定，而如此耗费时间与成本，且无法达成快速鉴定。 

用DNA辨识条形码来鉴别物种已广被国际认可，其中植物以转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)辨识度较高(Chen et al.,2010;Chiou et al.,2007;Heubl,2010;Shaw et al.,2002;Zhao et al.,2006;Ma et al.,2010;Miyamoto et al.,2006)。近年分析技术的进展逐渐以高解析双股分离动力分析(high-resolution melting analysis,HRMA)作为一种快速的辨识的方法(Zhou et al.,2011)。 

高解析双股分离动力分析(HRMA)的技术原理是利用在一定的温度范围内将聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增的产物先嵌入荧光物质，而后进行高温解离，将双股变成单股，同时侦测放出的荧光讯号。荧光值随着温度变化而绘制出熔解曲线。利用辨识物种DNA片段所具有独特的序列，因而形成独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性、重复性与鉴识度，可准确区别物种的同异，无需序列特异性探针或序列分析，被视为新一代的遗传扫描工具。 

有鉴于植物物种鉴定所使用序列间的相近与相异，并考量应用性、成本、灵敏度及分辨率，因此目前鉴定物种之方法中，急需导入特定高效引子的组合并结合HRMA技术，以标准化的流程来快速厘清药材的基原。 

发明内容

本发明提供一种鉴别一植物药材之种类的方法，包括：(a)获得一待测植物药材之DNA样本；(b)将该待测植物药材之DNA样本以至少一引子对进行一聚合酶链锁反应以获得一聚合酶链锁反应产物；(c)将该聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得该待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱；以及(d)将待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱与一已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱进行比对。 

本发明又提供一种建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法，包括：(a)获得至少一种已知植物药材之DNA样本；(b)将该至少一种已知植物药材之DNA样本以相同之至少一引子对分别进行聚合酶链锁反应以获得分别之聚合酶链锁反应产物；(c)将该分别之聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得该至少一种已知植物药材之分别的高解析双股分离动力分析图谱；以及(d)将该至少一种已知植物药材之分别的高解析双股分离动力分析图谱集合成一数据库。 

本发明还提供一种用于鉴别一植物药材种类的数据库，其系根据上述之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法来建构。 

本发明更提供一种用于鉴别一植物药材种类的引子对，包括：一顺向引子与一逆向引子的组合，其中该顺向引子系择自由下列所组成之群组：序列辨识号：1之引子、序列辨识号：2之引子、序列辨识号：3之引子、序列辨识号：4之引子、序列辨识号：5之引子、序列辨识号：6之引子及与序列辨识号：1、序列辨识号：2、序列辨识号：3、序列辨识号：4、序列辨识号：5或序列辨识号：6具70%以上序列相似度之引子，且其中该逆向引子系择自由下列所组成之群组：序列辨识号：7之引子、序列辨识号：8之引子、序列辨识号：9之引子、序列辨识号：10之引子、序列辨识号：11之引子、序列辨识号：12之引子及与序列辨识号：7、序列辨识号：8、序列辨识号：9、序列辨识号：10、序列辨识号：11或序列辨识号：12具70%以上序列相似度之引子。 

附图说明