[发明专利]降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白及其编码基因

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因。

背景技术

目前，我国现有高血压患者2亿多人，每年增加1000万人。高血压是心脑血管疾病的首要危险因素，高血压的常见心脑血管并发症（脑卒中、心脏病）约占居民总死亡的40%。另外，血栓病在中老年人中发病也较高，据国内外医学统计资料表明：脑血栓的致死率几乎占所有疾病的第一位。

降钙素基因相关肽（CGRP）是Rosenfeld等于1983年发现的一种生物活性肽，它与降钙素（CT）均来源于位于11号染色体的CT/CGRP基因，由于CT/CGRP基因不同的RNA编码而翻译成CGRP和CT，CGRP是应DNA基因重组和分子生物技术研究发现的一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽，是迄今发现的最强的内源性扩血管肽类物质，对神经、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系统具有重要作用。CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质，心钠素和去甲肾上腺素（NE），比乙酰胆碱（Ach）、5-羟色胺（5-HT）等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10-100倍。    

犬钩虫抗凝血肽（anticoagulant peptide，AcAPs）是犬钩虫吸血时，其头腺分泌一种具有抗凝血活性的物质，该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。AcAPs目前应用的有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三种重组蛋白。其中rAcAP5由77个氨基酸组成，含10个半胱氨酸，形成5对二硫键(C6-C50，C15-C42，C21-C37，C25-C69，C50-C63)，主要由二硫键决定其二级结构，从而决定其生物活性。它是Xa因子（凝血因子）的高效特异性抑制剂，阻断凝血的共同途径，达到抗凝血作用。AcAPs的抗凝血、抗血栓作用，使其在临床上成为一种新的抗凝剂和抗血栓药物。

然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。

发明内容

本发明的目的在于提供降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白及其编码基因，以期获得一种能同时具有治疗高血压和抗血栓双重作用的融合蛋白，两种蛋白之间作用互补且协同增效。

本发明降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的有益效果：本发明进行合理设计，将降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合，两者之间作用互补且协同增效，所得融合蛋白经实验证实具有很好的抗血栓和治疗高血压的作用。本发明的融合蛋白可由于制备抗血栓及预防和治疗高血压疾病的药物，为抗凝血及预防和治疗高血压疾病的研究打下基础。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本实施方式降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白的制备方法，按以下步骤进行：

一、融合蛋白CGRP/AcAP5基因的合成：CGRP和AcAP5融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAP5）载体； 

二、重组表达载体的构建：将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAP5）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAP5；

三、基因工程菌株的构建：然后将载体pGEX-CGRP/AcAP5转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒（购买自北京艾德莱生物科技有限公司）提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌；其中大肠杆菌BL21（DE3）为购买得到；