[发明专利]降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白及其编码基因

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因。

背景技术

Rosenfeld等于1983年发现降钙素基因相关肽（CGRP）是一种生物活性肽，它与降钙素（CT）均来源于位于11号染色体的CT/CGRP基因，但是由于CT/CGRP基因不同的RNA编码而翻译成CGRP和CT，CGRP是应DNA基因重组和分子生物技术研究发现的一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽，是目前发现的最强的内源性扩血管肽类物质，对神经、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系统具有重要作用。CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质，心钠素和去甲肾上腺素（NE），比乙酰胆碱（Ach）、5-羟色胺（5-HT）等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10-100倍。    

犬钩虫吸血时，其头腺能分泌一种抗凝血活性物质，被称作犬钩虫抗凝血肽（anticoagulant peptide，AcAPs）。该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间(pt)、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。目前发现的AcAPs有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三种重组蛋白，其中AcAPc2(10KD)是Xa因子的高效特异抑制剂，其抗血栓效果明显优于凝血酶抑制剂，AcAPc2作为Xa因子的高效特异抑制剂对血小板聚集功能影响甚小，用于抗血栓治疗时引发出血的危险性小。1998年，Donnelly等报道AcAPc2在体内还具有抗肿瘤细胞转移的作用。AcAPc2的抗凝血、抗血栓作用，使之具有成为临床上一种新的抗凝剂和抗血栓治疗药物。

然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。

发明内容

本发明的目的在于提供降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白及其编码基因，以期获得一种能同时具有治疗高血压和抗血栓双重作用的融合蛋白，两种蛋白之间作用互补且协同增效。

本发明降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的有益效果：本发明进行合理设计，将降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合，两者之间作用互补且协同增效，所得融合蛋白经实验证实具有很好的抗血栓和治疗高血压的作用。本发明的融合蛋白可由于制备抗血栓及预防和治疗高血压疾病的药物，为抗凝血及预防和治疗高血压疾病的研究打下基础。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本实施方式降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白的制备方法，按以下步骤进行：

一、融合蛋白CGRP/AcAPc2基因的合成：CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAPc2）载体；

二、重组表达载体的构建：将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAPc2；

三、基因工程菌株的构建：然后将载体pGEX-CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒（购买自北京艾德莱生物科技有限公司）提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌；其中大肠杆菌BL21（DE3）为购买得到；

四、融合蛋白的诱导表达与纯化：将阳性重组菌置于LB培养基28℃培养15h，然后采用GST标签融合蛋白方法进行蛋白的分离纯化，本实施方式降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为38.1%。

步骤二中pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切的体系如下：