[发明专利]一种重组猪白细胞介素2及其编码基因和表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪白细胞介素2及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。

背景技术

白细胞介素2（Interleukin-2，简称IL-2）是由活化的T淋巴细胞产生的一种重要的细胞因子，能激活T细胞和促进B细胞分化和分泌抗体，诱导产生干扰素，增强单核细胞以及自然杀伤细胞（natural killer cell，简称NK）的杀伤活性，在机体的免疫反应中具有重要的调节作用，是一类天然的免疫增强剂。在医学领域商品化的重组人白细胞介素2已经用于肿瘤、艾滋病、乙型肝炎等疾病的治疗。在动物医疗中，由于白细胞介素2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生，从而也展现出广阔的应用前景。目前，对鸡、牛白细胞介素2基因的研究较多，均已在原核和真核表达系统中表达，其中鸡的重组白细胞介素2能与多种病原疫苗一起使用，可显著提高免疫水平，减少应激，缓解疫苗的副反应，并有很强的治疗作用。但对于猪白细胞介素2基因的研究则较少，更没有猪白细胞介素2在原核表达系统中表达、纯化等方面的研究。而我国是世界上养猪大国，猪的疾病种类繁多，特别是病毒性传染病造成的发病率和死亡率最高，每年给养猪业造成巨大的经济损失。因此，提供一种生产量高适于产业化且对这些病毒性疾病的治疗和预防有效且经济实用的产品成为养猪业的首要任务。

在各种表达系统中，原核表达系统是最早被采用进行研究的，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：例如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应等，更重要的是原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，目的蛋白常以生物活性较低的包涵体形式表达。而包涵体的复性是一个复杂的过程，针对不同蛋白的个体差异性较大。如果复性条件应用的不适宜将导致分子内二硫键错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，不仅降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又易产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是采用合适的方法将大肠杆菌表达的重组猪白细胞介素2包涵体进行复性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达重组猪白细胞介素2以及其基因和表达、纯化、复性方法。

本发明提供了一种重组猪白细胞介素2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了编码上述所述重组猪白细胞介素2的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪白细胞介素2的基因的载体，所述的载体优选为原核表达质粒，最优选为pET21b。

本发明还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21（DE3）菌株。

本发明还提供了重组猪白细胞介素2在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：

该方法的步骤为：

1.挑取一个含有上述所述重组猪白细胞介素2的大肠杆菌菌落，接入50mL的LB培养液，在250mL摇瓶中于37℃培养过夜；

2.取5mL过夜培养物接入于500mL的LB培养液中，在2L摇瓶中于37℃震荡培养至对数中期（A₆₀₀=1.0）；

3.在培养物中加入IPTG至1mmol/L，于37℃，诱导表达4h后，于4℃以5000rpm/min，离心处理15min收集含有重组猪白细胞介素2的大肠杆菌菌体沉淀。

所述LB培养液中均含有氨苄青霉素50-100μg/mL。

本发明还提供了重组猪白细胞介素2的包涵体纯化方法，包括如下步骤：

1.将收集得到的上述含有诱导重组猪白细胞介素2大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4℃高速离心处理；重复一次。

2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（菌体湿重）加入裂解缓冲液BufferA3-10mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

3.每克（菌体湿重）菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。