[发明专利]重组丝氨酸蛋白酶抑制子、真菌表达载体及其杀虫真菌剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的丝氨酸蛋白酶抑制子，具体地说涉及含有真菌的分泌型信号肽和昆虫丝氨酸蛋白酶抑制子serpin序列的重组蛋白。

本发明涉及表达上述重组蛋白的真菌表达载体。

本发明还涉及表达上述重组蛋白的杀虫真菌剂。

 

背景技术

真菌是控制自然界昆虫种群数量的主要因素之一，以其为主要活性成份的生物农药已在我国、欧美及非洲得到广泛应用（冯明光, 《植物保护21世纪展望暨第三届全国青年植物保护科技工作者学术研讨会论文集》, 1998）。但生物农药，包括细菌、病毒及真菌类杀虫剂均存在击倒害虫时间过长和防效不稳定等缺点，因此如何提高这些生物类杀虫剂的效率，并研究其作用机理已成为该领域的一个研究重点。

在真菌侵染宿主的过程中，昆虫会利用自身的防御系统抵御真菌的侵入。昆虫体壁可以为其提供物理屏障，自身的免疫系统则可识别入侵的病原体，免疫细胞附着在病原体表面，吞噬病原体，形成黑色素。此外免疫系统还会产生大量的抗菌蛋白，抑制真菌的生长。研究者们以果蝇为模式生物，深入研究了昆虫的免疫反应。果蝇的免疫系统包括三个反应，体液免疫，由脂肪体产生一系列的抗菌肽，吞噬及黑化。果蝇受到免疫胁迫时产生的抗菌肽包括Drosomycin、Metchnikowin、Defensin、Attacin、Cecropin、Drosocin 和 Diptericin，其中Drosomycin、Metchnikowin 和 Cecropin对真菌有抑制作用。研究表明，果蝇在受到真菌胁迫时会激活sp?tzle/Toll/cactus信号途径（Toll途径）（Schneider DS et al.，Genes Dev, 1991，5:797-807），其中sp?tzle是Toll的配体，由丝氨酸蛋白酶活化。sp?tzle与Toll结合活化该途径，导致IκB-like蛋白和Cactus蛋白的降解和NF-κB-like、Dorsal和Dif的核转位，从而激活相关基因的表达(Nicolas E et al., J  Biol Chem, 1998, 273:10463-10469)。该途径中的Toll、sp?tzle、Tube或 Pelle发生突变，均会导致抗真菌肽Drosomycin的表达降低，昆虫对真菌感染高度敏感（Lemaitre B et al.，Cell, 1996, 86:973–83）。利用烟曲霉（Aspergillus fumigatus）孢子分别处理Toll突变体果蝇和野生型果蝇，突变体果蝇在2－3天后全部死亡，而野生型果蝇在处理6天后，仅有1/3死亡。分析显示，在Toll突变体中，抗真菌蛋白Drosomycin的表达显著降低（Lemaitre B et al.，Cell, 1996, 86:973–83）。上述研究表明，Toll信号途径是昆虫受到真菌侵染时的主要信号途径，阻抑该途径会造成昆虫对真菌病原体的抵抗力降低。因此，该途径成为菌株遗传改良的潜在靶标，但目前还没有相应的报道。

 

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的一个目的在于提供一种重组丝氨酸蛋白酶抑制子，其含有来源于真菌的分泌型信号肽和来源于昆虫的丝氨酸蛋白酶抑制子，具有抑制昆虫免疫反应和提高杀虫真菌毒力的特性，以解决昆虫病原真菌侵染效率低的问题。

本发明的另一个目的在于提供含有上述核苷酸序列的表达载体。

本发明的再一个目的在于提供产生本发明蛋白的杀虫真菌剂。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种重组丝氨酸蛋白酶抑制子，其特征在于，采用分子生物学技术构建一个重组核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的信号肽序列与编码果蝇的丝氨酸蛋白酶抑制子基因，其具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。

所述重组丝氨酸蛋白酶抑制子的构建方法，包括如下步骤：

1）果蝇serpin基因的克隆：

在果蝇的serpin基因中（NM_080112），有一个内含子，利用PCR互搭的方法去除内含子；分别以P1/P2，P3/P4为引物；引物序列如下：

P1: 5’-GAATTCATGGCGAGCAAAGTCTCGATCCTTCTCCTGC-3’，下划线序列为EcoRI位点；