[发明专利]一种应用角质酶进行酯合成的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用角质酶合成酯的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

酯是由酸与醇反应失水而生成的一类化合物，广泛应用于食品、酿酒、饮料、医药、保健品、日用化工等各领域。目前酯类物质的生产基本采用化学法，由无机催化剂（如浓硫酸）在高温下催化酸和醇的酯化反应而得。虽然生产成本较低，但过程中一些难以控制的副反应使得产品品质不高，强酸对设备的腐蚀也会增加维修费用，更重要的是，此法造成的环境污染不符合当今可持续发展的主流。而酶法合成酯类物质具有反应条件温和、能耗低、环境污染小、并且产品品质好的优势，因此开发酶制剂在酯合成中的应用重要的现实意义和经济价值。

角质酶是一种多功能酯酶，既可催化水解不溶性多聚物角质和各种聚酯的酯键，也可以作用于其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反应外，角质酶还能催化酸与醇的酯化、一些脂肪酸盐与醇的转酯化。目前已有报道来源于真菌F.solani的角质酶在短链酯合成中的应用，其中己酸乙酯合成的转化率最高，为97%，但加酶量很高，为240U/mL，且中长链的酯合成转化率很低。

本研究室在前期工作中鉴定了来源于Thermobifida fusca的两种角质酶Tfu_0882和Tfu_0883。本发明提供了该角质酶在酯合成中的应用方法。

发明内容

本发明提供了Thermobifida fusca角质酶在酯合成中的应用方法。

为解决上述问题，本发明技术方案为：

采用来源于Thermobififda fusca的角质酶进行酯合成，底物浓度为0.1-1M，酸与醇的摩尔比为1:1-2，加水量0.03-0.08%，加酶量为10-80U/mL，40-60℃、100-200rpm，反应时间4-15h，不同链长的酯的反应时间依据达到最高转化率时所需的时间而定。转化率以消耗的酸与初始的酸含量的比值来计。

上述酶促反应条件与酶的性质有关系，也可根据酶加入量调整相应的工艺参数。

所述酶促反应优先在有机溶剂中进行，并且有机溶剂的选用为本领域常规技术手段，更进一步地优先选用异辛烷或正己烷。

所述角质酶的生产方法为在一定培养条件下，以生产角质酶的重组大肠杆菌（Chen S,Tong X,Woodard RW，Du GC,Wu J,Chen J,Identification and Characterization of Bacterial Cutinase,The Journal of Biological Chemistry，2008,283（28）25854-25862）发酵一定时间，经过12000rpm，离心10min，去除菌体，上清即为粗酶液，再经过真空冷冻干燥，获得角质酶的酶粉。

所述角质酶活性的测定方法为：以对硝基苯丁酸酯（pNPB）为底物，采用分光光度法在20°C下测定。反应体系为1mL，包括960μL缓冲液(20mM Tris–HCl，10mM NaCl，50mM sodium taurodeoxycholate,pH8.0)，20μL酶液，20μL pNPB(1mM,乙腈中保存)，在405nm处，记录对硝基酚的生成速率。酶活定义：20°C下，每分钟催化对硝基苯丁酸酯生成1μM对硝基酚的酶量即为一个酶活力单位。

所述有机试剂和底物酸、醇均需用4A型分子筛除水，防止对反应体系中水含量的影响。

所述酸的检测方法为气相检测：仪器为GC-2010，GAS CHROMATOGRAPH SHIMADZU，色谱柱为RTX-WAX（30m×0.32mm），检测器为FID，载气为N₂，流速3mL/min，柱温条件为50℃（3min）-10℃min^-1-220℃（1min）。

具体实施方式

实施例1

本实施例以Thermobifida fusca来源的角质酶Tfu_0883进行催化反应。

有机试剂和底物酸、醇采用4A型分子筛除水之后用于酯合成。反应条件：0.1M酸、0.2M醇，加水量0.03%，50℃，150rpm，酶30U/ml，反应溶剂异辛烷，具体结果见表1、表2。

表1

表2

实施例2

本实施例以Thermobifida fusca来源的角质酶Tfu_0882进行催化反应。