[发明专利]帕尼单抗、西妥昔单抗靶向用药基因的检测方法及其引物

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对靶向用药基因突变位点检测的引物，特别涉及用Ion Torrent半导体芯片测序技术对帕尼单抗、西妥昔单抗靶向用药基因突变进行定性、定量检测的相关引物及其试剂盒。

背景技术

结直肠癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，目前世界范围内其发病率占所有恶性肿瘤第3位，在中国结直肠癌的发病率和死亡率也呈逐年提高，2011年我国的结直肠癌的发病率也位居全部恶性肿瘤的第3位。约半数的结直肠癌患者可以通过手术治愈，但大部分患者会发生转移或复发，并最终导致死亡。

近年来，随着肿瘤分子靶向治疗的兴起，帕尼单抗(Panitumumab，商品名：维克替比)和西妥昔单抗(Cetuximab，商品名：爱必妥)这两种针对表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor，EGFR)的单克隆抗体类药物在结直肠癌的治疗中显示了很好的疗效。

肿瘤分子靶向用药是以肿瘤细胞中所具有的特异性分子作为靶点，利用分子靶向药物特异性阻断该靶点的生物学功能，从而从分子水平逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为，达到抑制肿瘤的目的。

表皮生长因子受体是一种跨膜受体，本身具有酪氨酶激酶活性，配体与受体细胞外区结合后通过诱导两个邻近受体结合形成受体二聚体而激活受体，从而激活胞内酪氨酸结构域，引发激酶自磷酸化和下游分子的磷酸化，激活包括增殖和存活在内的多种细胞功能。

帕尼单抗和西妥昔单抗是一类针对EGFR的单克隆抗体，能阻止EGFR与其天然配体的结合，抑制肿瘤细胞增生，诱导细胞凋亡，增强细胞毒药物的抗癌能力。

KRAS基因是EGFR传导通路中一个重要的下游信号分子，该基因突变或过度表达后成为致癌基因。KRAS基因突变主要集中在第2号外显子的第12-13位密码子上、也有密码子61位的突变。KRAS基因的突变使RAS蛋白一直处于激活状态，不受上游EGFR信号分子的影响，使信号传递通道一直处于持续激活状态，刺激细胞不断的生长或分化。即使使用了EGFR佶抗剂(如帕尼单抗和西妥昔单抗等)阻断了上游信号传导，但KRAS促进肿瘤增殖的作用不受影响，即EGFR佶抗剂对KRAS基因突变的结直肠癌不能发挥抗肿瘤作用。

BRAF基因的突变是帕尼单抗和西妥昔单抗的另一个疗效预测因子。BRAF是EGFR信号转导通路中位于KRAS下游的一个重要的丝氨酸激酶。BRAF V600E基因突变是第十五号外显子的1799位核苷酸由胸腺嘧啶T转换为腺嘌呤A，导致编码氨基酸序列第600位的缬氨酸突变为谷氨酸，该突变导致EFGR激活的MAPK信号途径的组成型活化(持续活化状态)而使帕尼单抗和西妥昔单抗不能发挥抗肿瘤作用。结直肠癌患者BRAF基因突变的发生率很低，且BRAF基因突变只发生于KRAS基因野生型患者，在KRAS基因突变型患者中未曾检测到BRAF基因的突变。

通过检测KRAS和BRAF这两个基因的突变碱基，可以判断结直肠癌患者个体对帕尼单抗和西妥昔单抗的敏感性，筛选靶向治疗的最适合人群，从而避免了因为不合理用药而引起不必要的不良反应和经济损失。

目前，已报道的用于帕尼单抗和西妥昔单抗靶向用药相关基因突变的方法主要包括传统的如PCR产物直接测序法、高分辨率溶解曲线法(HRM)、单链构象多态性分析方法(SSCP)、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、焦磷酸测序方法、变性高效液相色谱法等，每种方法都各有优缺点，在应用上受到不同的限制。

Ion Torrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H⁺，H⁺在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H⁺的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。