[发明专利]以产甘油假丝酵母特征5.8S序列为整合位点的pURGAP载体构建及其应用

说明书

本发明公开了一种能用同源重组来克隆的产甘油假丝酵母整合载体pURGAP的构建及其应用。所构建的pURGAP载体包含有酵母Candida glycerinogenes的通过构建带有5.8S rDNA序列SEQ NO.2，可整合于酵母Candida glycerinogenes特征5.8S序列SEQ NO.1位点，所构建的pURGAP载体还包含有渗透压启动子P_CgGAP、zeocin抗性标记和在大肠杆菌高拷贝的所有元件。与其它整合载体相比，pURGAP以特征5.8S rDNA序列为整合位点可显著提高整合载体转化效率，并明显增强外源蛋白表达强度。所构建的pURGAP可有效地将外源基因或启动子在产甘油假丝酵母中进行整合表达，是提高表达载体的整合效率，加速工业菌株产甘油假丝酵母重组改造速度的一种重要方法。

技术领域

本发明涉及一种含有表达系统的整合载体以及由该整合表达载体转化工业酵母细胞一产甘油假丝酵母；涉及蛋白质表达基因工程领域，尤其是利用产甘油假丝酵母作为细胞工厂表达外源基因的研究领域，属于微生物学，基因工程和分子生物学领域。

背景技术

产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，曾获得国家发明二等奖，能在55％葡萄糖或15％NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，具有耐高渗，目标产物高产量、高转化率、生产强度大的特点。C.glycerinogenes具有两个显著特性，即耐高渗透压(超高浓醪发酵，节省提取能耗)和葡萄糖代谢途径完备，是一个可基因改造、具有的很好应用前景的潜在节能型模式菌株，对其进行遗传改良和途径工程改造就必须建立高效的遗传转化体系。

虽然常用的实验室酵母，如酿酒酵母S.cerevisiae的转化方法已经十分成熟，但这些方法用于工业酵母菌株的基因改造不理想，严重阻碍采用基因工程手段对产甘油假丝酵母代谢途径进行有目的的改造从而改进产甘油假丝酵母的性能，其主要原因是该工业酵母菌株的遗传背景复杂多样。因此，这就需要根据工业酵母菌株自身的特点，如细胞壁结构、生理生化特性、遗传背景等，建立起相应的转化体系。

实现建立起相应的转化体系这一目标首先要获得有效的载体，而构建酵母整合型载体的一项重要工作是获得整合位点。为建立有效的产甘油假丝酵母转化系统，本发明选择产甘油假丝酵母5.8S rDNA特征序列作为同源重组整合位点，构建适合于产甘油假丝酵母转化的整合载体，建立了一套高效、简单的产甘油假丝酵母转化系统。

发明内容

针对目前未见产甘油假丝酵母5.8S rDNA序列在产甘油假丝酵母表达载体中应用的现状。本发明利用产甘油假丝酵母的特征5.8S rDNA序列SEQ NO1构建产甘油假丝酵母整合表达载体如附图1所示，获得了一种能够显著提高载体转化效率的载体。

本发明提供了以C.glycerinogenes5.8S rDNA序列SEQ NO1为整合位点的重组表达载体的构建，构建整合表达载体的具体步骤：

1.产甘油假丝酵母部分核糖体DNA(ribosome DNA，rDNA)序列的克隆：引物rdna1、rdna2扩增产甘油假丝酵母特征5.8S rDNA，特征5.8S rDNA的序列见SEQ NO1。

rdna1：ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGC

rdna2：ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG；序列见SEQ NO1。

2.整合载体的构建(pUC18作为基本骨架)如附图2；

(1)将PCR获得的特征5.8S rDNA经Sac I和Hind III连到pUC18上，得到克隆载体pUC-5.8S rDNA；