[发明专利]一株产氨基甲酸乙酯水解酶的赖氨酸芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种梭形赖氨酸芽孢杆菌及其应用，特别是一种能合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶的梭形赖氨酸芽孢杆菌及其应用。 

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)，在医学上有重要用途，曾一度被用作治疗多发性骨髓瘤及慢性骨髓性白血病，以及作为麻醉剂使用。近年研究发现，氨基甲酸乙酯是一种人类潜在致癌物质，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，国际癌症研究机构在2007年把氨基甲酸乙酯列为2A类致癌物。氨基甲酸乙酯是一种伴随发酵食品（如酒精饮料、豆酱、酱油等）的生产过程中产生的副产物，对食品安全和生物体健康都有着严重的影响和危害。面对氨基甲酸乙酯所造成的食品安全问题，以微生物及酶降解实现食品中氨基甲酸乙酯的无危害化，是较理想的解决方案。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株产氨基甲酸乙酯水解酶的梭形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)SC02，已于2012年10月19日保藏于中国典形微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012414。菌落呈蜡样不透明，边缘不规则，菌落直径2-4mm，培养1-2天菌落为白色，3天后菌落颜色逐渐加深，最终显暗棕色。好氧或兼性厌氧。菌体革兰氏阳性，无荚膜，1000×显微镜下观察细胞呈杆状梭形，部分菌体顶端生有椭圆形芽孢。 

所述梭形赖氨酸芽孢杆菌分离自成年雌性小鼠肠道，其保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入营养肉汤培养基中，在30℃，200rpm，培养16h，取500μL培养液移入含有500μL40%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。 

上述的营养肉汤培养基为二形营养肉汤培养基，配方为蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，如需固体培养基，再添加2%琼脂。 

本发明的另一个目的是提供上述梭形赖氨酸芽孢杆菌的应用，其合成的耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶可以在NaCl浓度大于15%的条件下的条件下快速分解发酵食品中的副产物氨基甲酸乙酯并产生乙醇和氨气。其在最适pH8.0时具有最高酶活40U/g，在NaCl浓度大于15%的条件下，梭形赖氨酸芽孢杆菌所产生的耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶能够保持20%的酶活。 

本发明提供的梭形赖氨酸芽孢杆菌能合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶，在pH为8.0时具有最高酶活，能在高渗条件下快速分解氨基甲酸乙酯。在pH为8.0的条件下，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活为40U/g，在NaCl浓度大于15%的条件下，其能保持20%的氨基甲酸乙酯水解酶酶活。 

说明书附图 

图1梭形赖氨酸芽孢杆菌显微照片 

图2pH对梭形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影响 

图3梭形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶对NaCl的耐受性 

具体实施方式

实施例1：梭形赖氨酸芽孢杆菌筛选方法 

将25g每只5周大雌性昆明小鼠进行五天的强饲氨基甲酸乙酯溶液（200mg/kg body weight/day）后解剖，并用浓度为0.9%的生理盐水冲洗小鼠肠道组织，取组织悬浮液1mL于1000×g下离心10分钟，取上清液接种于富集培养基中（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g，氨基甲酸乙酯10g，水1000mL，pH7.0），30℃下通气培养20h。培养液于2000×g离心5min，取上清涂布于筛选培养基（牛肉浸膏10g,蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯30g，琼脂20g，水1000mL，pH5.0）中培养三天。挑选菌落形态较大的菌株转移到营养肉汤培养基中培养20h后进行保藏。 

挑取-80℃保藏的菌株在营养肉汤琼脂固体培养基上划线，于37℃培养24h后，挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，37℃在转速为200rpm的摇床培养24h，离心5min(12000rpm,4℃)后收集菌体，再用pH7.0的磷酸盐缓冲液重悬浮菌体至0.1g/mL。通过超声破碎进行酶粗提液的提取，对粗酶液进行氨基甲酸乙酯水解酶酶活测定检测到一株具有氨基甲酸乙酯水解酶活性的菌株，通过16S rDNA序列分析可知该菌株为一株梭形赖氨酸芽孢杆菌，已于2012年10月19日保藏于中国典形微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012414，保藏地址为中国武汉武汉大学。 

实施例2：氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的提取方法