[发明专利]一种制备猪瘟活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用激流灌注式生物反应器制备猪瘟活疫苗的方法，属于生物技术领域 

背景技术

猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）俗称“烂肠瘟”，在美国称为猪霍乱，欧洲一些地区称为古典猪瘟。本病是由猪瘟病毒引起的一种急性热性全身性败血性传染病，各种年龄猪只均可发病，病程从急性到慢性等多种多样。一年四季流行，传染性极强，具有高度发病率和死亡率，一旦发生具有毁灭性，严重地威胁养猪业的发展和影响人民的生活。在猪病中，猪瘟是危害最大、最受重视的一种病，此病被国际兽医卫生组织法定为必检的A类16种传染病之一，在我国被列为一类传染病。 

我国研制的猪瘟病毒兔化弱毒（C株）是国际公认的最佳猪瘟病毒疫苗株，已被欧洲很多国家采用，有效的控制了猪瘟的流行。近年来猪瘟常有免疫失败的报道，其原因虽然很多，但疫苗的质量有很重要的影响。猪瘟活疫苗的传统转瓶培养或静置培养工艺虽已沿袭数年，但难以摆脱效价不稳定，批间差异大，病毒滴度低等弊病，极大地限制了猪瘟活疫苗的质量与产量。 

近几年，随着兽用疫苗行业的发展，生物反应器被广泛关注，利用生物反应器替代传统的转瓶生产工艺已成为行业发展的趋势。国内已有应用生物反应器生产猪瘟活疫苗的研究报道。从行业整体发展来看，应用生物反应器生产猪瘟活疫苗比转瓶工艺有很大的进步，但在生产工艺优化与成本控制等方面均有很大的发展空间。应用激流灌注式生物反应器生产猪瘟活疫苗的研究未见报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种利用激流灌注式生物反应器制备猪瘟活疫苗的方法。由以下技术方案实现的： 

一种制备猪瘟活疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反应器作为培养工具，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵、第二蠕动泵、第三蠕动泵、第一硅胶管、第二硅胶管、第三硅胶管、有孔硅胶管、纸片载体、灌注袋、混匀器与激流罐；其中，混匀器是具有加热或保温功能、并能对内部液体进行混匀的罐状装置；所述反应器中液体的流向为：灌注袋——硅胶管——混匀器——硅胶管——激流罐——硅胶管——灌注袋；

活疫苗制备按以下步骤进行：

a.细胞接种

将细胞悬液即猪睾丸细胞ST和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（9），使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体（8）上，细胞接种密度为：每克载体接种0.8～1.5×10⁷个细胞；

b.制苗用细胞培养

设定设备参数：温度T1：36.5～37.5℃、T2：40～42℃、T3：34～36℃，pH：7.2～7.4，DO：50%～70%，振荡速度15～30r/min，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

c.病毒接种

当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将猪瘟病毒接种制苗用细胞，接种剂量为有效培养体积的0.3%～1%（V/V），吸附15～30min；加入细胞维持液；

d.病毒培养与收获

设定设备参数：温度T1：36～37℃、T2：39～41℃、T3：33～35℃，pH：7.3～7.5，DO：50%～70%，振荡速度15～30r/min，空气流量400ml/min～4000ml/min，启动病毒培养程序，扩增培养猪瘟病毒；

e.病毒液收获

接毒后每72h收获一次，多批次收获病毒液，保存备用；

f.疫苗制备

向病毒液加入冻干保护剂，分装、冻干，制得猪瘟活疫苗。

上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述步骤a中，种子细胞为猪睾丸传代细胞ST，为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞，应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过兔体定型热反应法筛选猪瘟病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。 

上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述步骤b中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于1.5g/L时，流加补充细胞生长液，流加速度以培养液含糖量维持在1.5～2g/L之间为准，当培养液体积达到有效培养体积时，更换培养液。 

上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述步骤b中，逐日增加空气流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。 

上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述步骤d中，接毒24h后开始持续流加补充n倍浓缩DMEM液，流加速度以培养液残糖量维持在1～2g/L之间为准；所述n等于2～5。