[发明专利]一种用于检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的制备

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体地涉及一种用于定量检测白酒样本中的塑化剂(DBP)残留量的酶联免疫试剂盒及检测方法。 

背景技术

塑化剂是一种增加材料的柔软性或是材料液化的添加剂。邻苯二甲酸酯类塑化剂被归类为疑似环境荷尔蒙，其生物毒性主要属雌激素与抗雄激素活性，会造成内分泌失调，损害生物体生殖机能，包括生殖率降低、流产、天生缺陷、异常的精子数、睾丸损害，还会引发恶性肿瘤、造成畸形儿，导致儿童性早熟。 

邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）是一种常用的塑化剂，也用作胶粘剂和印刷油墨的添加剂，也可用作一种杀体外寄生虫药。它具有较强的生殖毒性，可引起男性生育能力下降，尤其对儿童的毒性更大。DBP主要存在于人造革、塑料制品、化妆品、香精及农药中。 

目前，检测塑化剂的方法主要有高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC等。其中，高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC是定量的检测方法，结果准确可靠，缺点是检出限较高、仪器设备较为昂贵，以及复杂的样本前处理方法，限制了该方法的广泛应用。酶联免疫吸附ELISA法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用。本发明旨在建立一种检测塑化剂 (DBP)的ELISA试剂盒的制备及检测方法。 

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了检测塑化剂 (DBP)的ELISA试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。本发明提供了一种用于检测塑化剂 (DBP)的ELISA试剂盒的制备。 

检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的制备，包括酶标板、塑化剂(DBP)标准品、塑化剂(DBP)抗体工作液、酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。 

检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、塑化剂(DBP)标准品的制作、塑化剂(DBP)单克隆抗体及其工作液的制备、酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。 

其进一步特征在于：所述的塑化剂(DBP)包被抗原是将塑化剂(DBP)半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)；用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将塑化剂(DBP)抗原稀释成1:20000比例，100 μL/孔，37℃放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。 

所述的塑化剂(DBP)标准品浓度分别为0 ppm、0.1 ppm、0.3 ppm、0.9 ppm、2.7 ppm、8.1 ppm。 

塑化剂(DBP)蛋白质偶联物单克隆抗体工作液的制备：采用塑化剂(DBP)人工抗原免疫兔所得到，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成1:40000。 

所述酶标二抗工作液的制备：用酶标二抗稀释液稀释成1:5000比例；所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5% 吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。 

塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤： 

    (1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

    (2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

    (3)取包被有塑化剂(DBP)抗原的酶标板，加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中；

    (4)加入酶标二抗工作液，50 μL/孔，然后加入塑化剂(DBP)抗体工作液，50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；

    (5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300 μL/孔，充分洗涤4次，浸泡15-30 s，用吸水纸拍干；