[发明专利]一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法

权利要求书

1.一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）高效提取粗酶：将小麦胚芽机械粉碎至100目，然后用含有表面活性剂、pH=7.0的磷酸钠缓冲液混合，小麦胚芽︰缓冲液质量比0.3-1︰1，混合振荡30min，控制与混合液质量比1︰1加入正己烷溶解除油，12000rpm室温离心10min后取上清，得粗酶液；

（2）硫酸铵沉淀和浓缩：将提取的粗酶液边搅拌边加入固体硫酸铵，使其中硫酸铵浓度为10%－15%，摇匀后静置，然后在转速4000rpm下离心10min，弃去上清，将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液，回收率大于90%；选用过滤分子量为10000－15000Da的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩，获得超滤液；

（3）离子交换层析：采用离子交换柱层析纯化步骤（2）所得超滤液中的脂肪酶，装柱后，用pH 8的0.05 mol/L磷酸钠缓冲液平衡；将超滤液上样，上样量为柱体积的2－3倍，以含有1mol/L的NaCl的pH 8的0.05 mol/L磷酸钠缓冲液线性或梯度洗脱，流速为 1-5 mL/min，出现两个洗脱峰，收集活性峰，用透析袋浓缩；

（4）合成亲和介质：小麦胚芽脂肪酶亲和配体为脂肪酶抑制剂嘧啶的结构类似物，层析介质是Sepharose、壳聚糖、硅胶或陶瓷颗粒中的一种；小麦胚芽脂肪酶亲和配体和由环氧氯丙烷活化后的层析介质通过和乙二胺、1,3-丙二胺、2-羟基-1,3丙二胺、1,4-丁二胺、1,6-己二胺中的一种作为间隔臂进行连接，合成亲和介质；

（5）吸附和洗脱：将经过离子交换后步骤（3）收集的酶液用步骤（4）合成的亲和介质进行亲和吸附，亲和吸附的条件为 pH 6.5~8.0，电导率为5-10 ms/cm；然后采用清洗液冲洗吸附脂肪酶的亲和介质，清洗液冲洗条件为 pH 6.5~7.5，电导率5~10 ms/cm；最后用洗脱缓冲液洗脱亲和介质上吸附的酶，洗脱条件为 pH 3.0-4.5，得到纯酶，立即用0.1M Tris溶液中和至中性。

2.根据权利要求1中步骤（1）所述的表面活性剂为Triton X-100，吐温-20，吐温-80或SDS中的一种。

3.根据权利要求1所述的提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述离子交换柱选用DEAE-sepharose，DEAE-纤维素，Q-sepharose或superQ-sepharose中的一种。

4.根据权利要求1所述提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，其特征在于，步骤（4）所述的亲和配体，嘧啶的结构类似物是苯甲嘧啶、胞嘧啶或精氨酸中的一种。