[发明专利]一种新型手足口病疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种手足口病疫苗及其制备方法，尤其涉及手足口病疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)微小核糖核酸病毒科肠道病毒属，分为A、B、C三种基因型。EV71极其渺小，为正2 0面体、直径27nm、内含一条单股RNA。同时该病毒还具有以下特性：不耐强碱、56℃以上高温失去活性；紫外线可降低其活性；甲醛、含氯漂白水等化学物质可抑制其活性；没有脂质胞膜，故亲脂性消毒剂如酒精对其无用。

EV71和柯萨奇病毒A16 (CA16)是手足口病(HFMD)重症病例的主要病原体，且能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病，致残及病死率很高，备受人们关注。

1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚患者中分离到EV71，随后世界上许多国家相继报道了EV71在不同地区的流行情况。近年来，EV71感染引起的手足口病在亚太地区，尤其在我国北京、安徽、河南、山东等地较为严重。当前，我国流行的手足口病主要是由肠道病毒71型(EV71)引起的急性传染病，多发生于学龄前儿童。病人和隐性感染者均为传染源，主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径传播。致死原因主要为脑干脑炎及神经源性肺水肿。

目前，EV71疫苗的研究己取得一定的进展，正在研发的疫苗包括灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗和转基因口服疫苗。如C Chung 等构建并纯化了EV71 病毒样颗粒(VLP) ，应用纯化的VLP、变性的VLP 和热灭活的EV71 病毒，分别对小鼠的进行了免疫。Wu CN 等用VP1 DNA 疫苗、福尔马林灭活疫苗和VP1 原核表达亚单位疫苗等三种EV71 疫苗对实验母鼠进行免疫接种，比较了新生小鼠对野生型EV71 产生的免疫保护效果。结果表明，三种疫苗都有一定的免疫保护效果。HF Chen 等培育了能表达EV71 蛋白的转基因番茄,新鲜番茄中的表达量达到了27 mg/ g。用该转基因番茄喂养小鼠,能刺激小鼠产生细胞免疫和体液免疫,促进脾细胞增殖。在粪便和血清中,能够分别检测到针对VP1 特异性的IgA 抗体和IgG抗体。

虽然各种疫苗均具有一定的免疫原性和免疫效果，但最适疫苗的确认还需要对各种疫苗进行安全性和有效性的评价。

基因工程重组亚单位疫苗是指利用重组DNA技术，将病原的保护性抗原基因在不同的表达系统中体外表达，生产能诱导机体产生保护性免疫反应的病原蛋白质，再经分离纯化而制备的疫苗。基因工程亚单位疫苗除了亚单位疫苗的优点外，还有制备简单，成本较低等传统亚单位疫苗无法比拟的优越性。目前疫苗市场仍以常规传统疫苗为主，从生物疫苗的研究开发角度出发，利用先进的基因工程技术不仅可开发新型疫苗，还可用于改进现有疫苗。一些重组疫苗已商品化成品问世应用于临床，例如我国自行研制开发的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的乙肝基因重组疫苗已在卫生部长春生物制品研究所投人生产，还有重组甲肝及戊肝疫苗，故手足口病基因工程重组疫苗是该疾病疫苗开发的方向。

发明内容

本发明通过重组DNA技术，将病原的保护性抗原基因EV71 VP1在表达载体—pIRES-VP1-dhfr，转染CHO细胞，获得能诱导机体产生保护性免疫反应的病原蛋白质，再经分离纯化而制备的疫苗。相比于传统手足口病疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

上述病毒表达载体—pIRES-VP1-dhfr的制备方法包括以下步骤：

(1)由PCR扩增的方法获得病毒囊膜蛋白信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白跨膜域基因序列，通过BamHI EcoRI和XhoI Hindlll双酶切插入载体多克隆位点上下游两端构建的病毒表面；

(2)由PCR扩增的方法获得手足口病主要抗原蛋白基因EV71 VP1序列，其5’和3’端分别引入EcoR I和Xba I酶切位点后构建成重组病毒表达载体pIRES-VP1-dhfr；

(3)取步骤(2)所得的重组病毒载体转染CHO细胞，筛选高表达单克隆细胞系；

(4)取步骤(3)所鉴定成功的重组病毒基因组转染CHO细胞，获得含重组病毒，提取病毒基因组用M13引物进行PCR鉴定，获得所述重组病毒载体。

本发明进一步提供上述家蚕重组杆状病毒Bmgp64VPl在手足口病疫苗制备中的应用。