[发明专利]一种诱导石榴枯萎病菌产生致病性分泌蛋白的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种诱导石榴枯萎病菌产生致病性分泌蛋白的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

石榴枯萎病为最近几年在中国云南和四川省石榴种植发生的新病害，已经造成大量的经济损失，这种病害为病原真菌甘薯长喙壳菌 (Ceratocystis fimbriata) 引起。2004年在云南省蒙自县石榴枯萎病造成的经济损失达 1500 万元以上，其中部分重病区病株率高达 29.2%，特别是挂果石榴树的大面积死亡，造成石榴产业的毁灭性损失。甘薯长喙壳菌为子囊菌亚门长喙壳属真菌，是经典遗传学和分子遗传学的良好试验材料。近年来的研究获得了许多与侵染相关的形态分化和致病因子的遗传资源和信息，为石榴枯萎病菌的分子生物学研究打下了良好的基础。

大量研究表明，不同病原菌菌株致病性差异十分明显，在病原菌与寄主植物长期的军备竞赛与协同进化中，病原菌进化出了许多不同的方式来破坏寄主植物的免疫机制，如破坏寄主的细胞壁，抑制特定的信号转导或特定基因的表达等等。许多研究结果表明，病原菌的分泌蛋白在上述过程中扮演着重要的甚至决定性的作用。分泌蛋白是指在细胞内合成分泌到细胞外发挥功能的蛋白,通常是由信号肽引导通过细胞膜被运输到达胞外。分泌蛋白组学(Secretome)的研究目前已成为蛋白质组研究领域的主要方向。近年来的研究表明，病原菌产生的分泌到寄主组织和细胞内的蛋白在二者的互做中发挥着重要作用。病原菌的分泌蛋白中许多是细胞分泌到胞外的酶类，这些酶类对于微生物与周围环境的物质、能量和信息交换具有重要的意义。病原菌的分泌蛋白与致病性或无毒性密切相关，从而使分泌蛋白成为研究寄主—病原菌互作的热点之一。在植物与病原菌的互作中，病原菌的分泌蛋白可能是感知周围环境并做出各种响应的主要感应蛋白。它们与寄主细胞中相关蛋白发生的互作可引发寄主一系列的与病害发展相关的生理生化反应。在植物与致病真菌的互作系统中, 与致病相关的分泌蛋白主要是病原菌无毒基因、致病基因的产物及与这两类基因调控相关的蛋白。因此，研究病原菌的分泌蛋白对于深入了解其与寄主互作的机制有着重要的意义。

但是多年的研究结果表明，目前，还没有能够诱导石榴枯萎病菌产生分泌蛋白的方法，限制了对其致病机理的深入研究。

发明内容：

本发明的目的是克服石榴枯萎病菌在固体培养条件下无法产生大量致病性分泌蛋白的不足，提供一种诱导石榴枯萎病菌产生致病性分泌蛋白的方法。

本发明的技术具体方案为：

(1) 石榴枯萎病菌菌株接种在PDA固体培养基上，26℃下培养；PDA固体培养基成分组成：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉17g/L、H₂O 1L；

(2) 待形成较大的菌落，用接种针挑取菌丝，转接到150mL的蔗糖液体培养基，26℃，170rpm振荡培养72小时；蔗糖液体培养基成分组成：蔗糖20g/L，酵母提取物5g/L，H₂O 1L，pH 6.3；

(3) 将培养好的菌液抽滤，采用常规的硫酸铵沉淀法沉淀后得到石榴枯萎病菌分泌蛋白的提取物，透析后冻干保存，-20℃保存，即得石榴枯萎病菌胞外分泌蛋白样品。

将得到的蛋白提取物用50μL灭菌去离子水溶解后在石榴叶片上做接种试验，验证所提取蛋白的生物学功能。

本发明具有工艺简单、成本低，石榴枯萎病菌胞外分泌蛋白样品能用于后续对其进行功能测定和双向电泳分析，具有较大的实际应用价值。

具体实施方式：

实施例1：

将斜面上保存的石榴枯萎病菌菌株（生物型Ⅱ：强致病性）SQ1、SQ5菌株接种在由土豆（200g/L）、葡萄糖(20g/L)、脂粉(17g/L)和H₂O(1L)组成的PDA固体培养基上，26℃下培养。待形成较大的菌落且产生子囊壳后，用接种针挑取菌丝，转接到由蔗糖（20g/L）、酵母提取物（5g/L）、H₂O（1L）、pH 6.3的蔗糖液体培养基中，26℃，170rpm振荡培养72小 时；用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经5000rpm离心8min，上清液在0℃ 冰浴加入100％硫酸铵(697g/L)进行沉淀，10000rpm离心15min，沉淀经1KD截流范围透析带透析处理，-86℃真空冻干后获得石榴枯萎病菌致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存。分别将所提取、保存的分泌蛋白接种到寄主石榴叶片，接种4天后调查坏死斑大小，结果见表1。

实施例2：